Вектори для трансформації клітин рослин
Для перенесення (трансформації) чужорідних генів у клітини вищих рослин і тварин сконструйовано спеціальні вектори.
Існуючі та потенційні вектори для рослин можна розділити на декілька категорій:
1) вектори, отримані на основі бактерійних плазмід, здатних інтегруватись у геном рослин-реципієнтів – це Ті-плазміди Agrobacterium tumefaciens і Ri-плазміди Agrobacterium rhizogenes;
2) вектори, сконструйовані на основі ДНК-вірусів рослин;
3) вектори, які можуть існувати в рослинних клітинах як незалежні реплікони (мітохондріальна та хлоропласта ДНК);
4) вектори, отримані на основі нестабільних компонентів геному рослин (транспозонних елементів).
Перші вектори на основі Ті- і Rі-плазмід, які були сконструйовані у 1962 р. використовували для порівняно малої кількості рослин (тютюну, льону, моркви). Більшість модельних експериментів проведено на рослині тютюну.
Успішні переноси генів у рослини з допомогою Ті-, а потім Ri-плазмід розпочались з 1981 р. Перші спроби введення сторонніх генів у рослини за допомогою Ті-плазмід стосувалися переважно бактеріальних генів, що несуть ознаки стійкості до антибіотиків (метатрексату, канаміцину, неоміцину). Ці досліди були необхідні для того, щоб переконатись у можливості стабільної трансформації рослинних об’єктів чужими, в даному випадку прокаріотними, генами. В подальшому бактеріальні гени резистентності до антибіотиків використовувались як селективні маркерні гени за добору рослинних клітин, трансформованих в інших напрямках. Для більш успішного введення в рослині клітини і протопласти бактеріальних генів були сконструйовані ’’човникові’’ або ’’проміжні’’ вектори, здатні стабільно підтримуватись як в клітинах A . tumefaciens, так і в клітинах E . coli. В останні роки на основі Ті-плазмід створено штучні космічні вектори, невеликі за розмірами, які вдало поєднують можливості декількох ’’човникових’’ плазмід і природної системи трансформації у A . tumefaciens.
|
|
|
На сьогодні за допомогою Ті-плазмід здійснено перенесення багатьох десятків генів вищих рослин, включаючи обмін генами між двома таксономічно віддаленими видами. Одна із перших експериментальних розробок у цьому напрямку – перенесення гена фазеоліну бобів у клітини соняшника. В калусній масі трансгенного соняшника імунологічно виявлялися фазеолінові поліпептиди, що свідчило про успішне перенесення відповідного гена від однієї родини рослин до іншої.
Пізніше було здійснено успішне перенесення гена Z4 зерна з клітин кукурудзи в клітини соняшника, гена фазеоліну в рослини тютюну.
Модельні досліди привели до отримання трансгенних рослин з наявністю в їх геномі генів тваринного походження. Так, наприклад, у рослини петунії перенесено ген дигідрофолатредуктази мишей, внаслідок чого клітини петунії набули резистентності до метатраксату. Успішна експресія цього гена в клітинах рослин була досягнена приєднанням гена миші до промотора вірусу CaMV, який нормально експресується в рослинах. Досліджена експресія химерного гена нопалінсинтетази і гормону росту людини в трансформованих калусних клітинах петунії і тютюну. Нормальна експресія гена людини була наслідком його вбудови між промотором і термінатором nos -гена Т-ДНК.
|
|
|
Наступні успішні експерименти з отримання трансгенних рослин продемонстрували можливість конструювання рослин з прогнозованими властивостями, що вкрай необхідно для створення унікального вихідного матеріалу для селекції. Отримано докази того, що перенесення Т-ДНК і експресія генів Т-ДНК можливі принаймні у деяких однодольних рослин. Це вселяє надію на те, що Ті- та Ri-плазміди можуть бути використані для спрямованої трансформації однодольних, наприклад, для переносу генів азотфіксації від бульбочкових бактерій до злакових рослин. Інтенсивні дослідження у цьому напрямку проводяться в ряді країн.
|
|
|
Як відбувається перенесення Т-ДНК
Пошкоджені ділянки рослин (найчастіше механічні) виділяють хімічні сполуки, які індукують транскрипцію vir-ділянки Ті-плазміди (відповідальна за вірулентність). Одна з цих сполук ідентифікована як ацетосірінгон, інші неідентифіковані. Передбачають, що дія продукованих пошкодженою ділянкою сполук сприяє тому, що продукт гена vir A впізнає і взаємодіє з ацетосірінгоном і цей сигнал передається всередину клітини, де активує ген virG. Білок продукт гена virG активує решту генів вірулентності (vir B , C , D , E) і також підвищує рівень транскрипції virG. Індукція генів vir сприяє утворенню однониткових розривів граничних послідовностей довжиною 25 п.н., які фланкують Т-ДНК. Т-ДНК переноситься у клітину рослини (механізм невідомий). Можливо аналогічно бактерійній кон’югації.
Утворення корончастих галів-пухлин за інфікування рослини A . tumefaciens супроводжується стабільною інтеграцією сегмента наявної у вірулентних агробактеріях Ті-плазмід в ДНК ядер клітин рослини. Внаслідок цього досить протяжна послідовність бактеріальної плазміди (так звана Т-ДНК) стає складовою частиною спадкового апарату трансформованої (пухлинної) рослинної клітини. Гени Т-ДНК обумовлюють гіперпродукцію фітогормонів (цитокінінів і індолілоцтової кислоти), а також синтез ряду похідних амінокислот, об’єднаних загальною назвою – опіни. Все це відбувається лише за умови трансформації рослинної клітини Ті-плазмідою. Опіни, що синтезуються в клітинах пухлин, бактерія використовує як джерело вуглецю і азоту для свого росту і розвитку. Все сказане свідчить про те, що Ті-плазміда – це природній вектор для трансформації клітин вищих рослин.
|
|
|
Будь-яку клоновану ДНК можна перенести у геном клітин дводольних рослин, використовуючи Ті-плазміди. Чужорідна ДНК, яку хочуть перенести у клітину, повинна бути франкована кінцевими послідовностями Т-ДНК і стабільно підтримуватися у штамі агробактерій
Ген, що переноситься і клонується, вбудовують у Т-ДНК Ті-плазміди замість кодуючої частини генів опінів. Після зараження рослини такою химерною плазмідою її Т-ДНК із штучно вбудованим геном інтегрується в хромосому ДНК клітини-хазяїна. Встановлено, що таким способом може ефективно переноситись і стабільно інтегруватись у хромосомі рослин досить протяжна послідовність чужорідної ДНК (довжиною 50 тис. п. н. і більше).
З’ясувалося, що чимало чужих генів, перенесених у клітини рослин за допомогою Ті-плазмід, стабільно зберігаються в рослинах-регенерантах і успадковуються, але їх експресія на рівні синтезу відповідних білків не виявляються. Так, гени a-актину курчат і алкогольдегідрогенази дріжджів не транскрибувалися після їх перенесення в клітини тютюну, хоч в генерованих клітинах ген, наприклад дріжджів, виявлявся в численних копіях. Приблизно така ж ситуація спостерігається за перенесення в рослини інших генів: канаміцин-резистентності Tn5 E . coli, геномного клону казеїну кукурудзи.
Відсутність експресії в цих та інших випадках трансгену пояснюється тим, що сигнали розпізнавання і відповідної регуляції в чужорідній ДНК не сприймаються ферментами клітини-хазяїна. Щоб усунути цю перешкоду, в вектори, штучно створені на основі Ті- та Ri-плазмід, вводять найбільш ефективні в умовах рослинних клітин промотори, термінатори. Найбільш ефективними в цьому відношенні виявились промотори Т-ДНК, наприклад промотор nos -гена (нопалінсинтетази) Ті-плазміди. Він не містить канонічної прокаріотичної послідовності і є скоріше еукаріотичним за функціональними і структурними критеріями. Тому його, як і деякі інші, часто використовують при конструюванні химерних генів і химерних проміжних плазмід для трансформації рослин. Вектори з nos -промотором придатні для широкого кола хазяїв; вони функціонують у калусах всіх дводольних рослин і практично в усіх регенерованих тканинах.
Слід зазначити, що, крім векторів на основі Ті- та Ri-плазмід, широко використовуються вектори, сконструйовані на основі вірусів, наприклад, С aMV(cauliflower mosaic virus – вірус мозаїки цвітної капусти), деяких РНК-фітовірусів та віроїдів. Трансформація рослинних клітин плазмідами утруднюється наявністю клітинних стінок, тому для роботи використовують протопласти, тобто клітини без стінок. Особливо необхідним є використання протопластів у генетичній інженерії однодольних рослин, наприклад злаків, які не інфікуються агробактеріями. У цих випадках використовують здатність молекул ДНК поглинатися протопластами (явище трансформації). Сьогодні, крім методів трансформації, використовують мікроін’єкції, електропорацію, перенесення ДНК за допомогою ліпосом, сумісне культивування протопластів рослин зі сферопластами бактерій.
При перенесенні векторів при використанні протопластів (методи прямого перенесення ДНК у рослинні клітини) необхідно забезпечити захист векторів від ендонуклеаз і ефективне захоплення векторів клітиною. Для цього проводять експерименти використовуючи ZnCl2 або високі значення рН (біля 10), що інгібує рослинні протеази. Іншим видом захисту є використання ліпосом, у які всередину заховують ДНК. Ефективне захоплення ДНК клітинами забезпечують шляхом використання сполук, які стимулюють ендоцитоз (поліетиленгліколь у концентрації 25-30% та інші більш токсичні для клітин – полівініловий спирт, полі-a-лізин, полі-a-орнітин, поліаніон-декстран-сульфат). Кількість ДНК і поліетиленгліколя має бути невисоким, оскільки більші кількості призводять до пошкодження клітин. Після проведення експеримента додають ДНК-ази для видалення незахопленої ДНК і проводять контроль ефективності перенесення вектора використовуючи блотинг-гібридизацію за Саузерном.
Генна інженерія відкриває блискучі перспективи розвитку досліджень у напрямку поліпшення продуктивності культурних рослин, включаючи співвідношення та амінокислотний склад запасних білків, толерантність рослин до стресових умов середовища, стійкість до пестицидів та інших отрут, скоростиглість, врожайність. Слід, однак, зважати на те, що більшість найцінніших агрономічних властивостей рослин контролюється недостатньо вивченими мультигенними системами. Це значно ускладнює використання генної інженерії і створює проблеми для вирішення яких потрібні великі кошти і значний час.
Заключна частина (5- 10 хв)
Задавайте будь ласка питання які у вас виникли під час лекції.
На завершення давайте згадаємо які вектори ми сьогодні вивчали.
На даній лекції ми поглибили свої знання з генетики мікрооргнізмів, а саме поговорили про загальну характеристику векторів, охарактеризували плазмідні, гібридні вектори та вектори створені на основі бактеріофагів, поговорили про види векторів для тррансформацції клітин рослин.
Дякую за увагу!
Лекцію закінчено.
До побачення!
Дата добавления: 2022-01-22; просмотров: 22; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!