Характеристика плазмідних векторів
I. Мета:
Навчальна: розширити знання студентів про генотип мікроорганізмів, розкрити особливості будови векторів для клонування у бактерій
Розвиваюча: розвивати уміння порівняти природні об’єкти, використовуючи вже отримані знання та нові
Виховна: виховувати спостережливість, уяву
II. Методи, прийоми, засоби:
Методи, прийоми передачі та обміну словесною інформацією:
· розповідь;
· діалог.
Методи, прийоми розвитку мислиннєвих дій:
· порівняння;
· аналогія;
· узагальнення.
III. Наочність: таблиці, схеми, фотографії
технічні засоби (ноутбук, проектор)
IV. Основні питання лекції:
1. Плазмідні вектори;
2. Фагові вектори;
3. Гібридні вектори;
4. Вектори для трансформації клітин рослин.
V. Рекомендована література:
Основна:
1. Глик Б., Пастернак Дж., Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. – М.:Мир, 2002. – С. 589.
2. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия: Учеб.- справ. Пособие. – 2-е изд.- Новосибирськ, 2004, - С. 498.
3. Щербанов В. Н. Биотехнология. Учеб. Пособие для вузов. В 8 кн./ Под. ред. В. Г. Дебабов. –М.: Высш. шк., 1988. – С. 208.
Додаткова:
1. Тоцький В. М., Генетика: Підручник/2–е вид., випр. Та доп.- Одеса: Астропринт, 2002. – С. 712.
2. Сергійчук М.Г., Повзур В.К., Вінніков А. І. Та ін. Мікробіологія:Підручник. – К.: Видавничо-поліграфічний центр “Київський університет”, 2005.-С.375.
VI. Основні питання, що розглядаються під час лекції:
|
|
|
1. Загальна характеристика векторів;
2. Характеристика плазмідних векторів;
3. Вектори на основі бактеріофага λ
4. Гібридні вектори;
5. Плазмідні вектори інших бактерій;
6. Вектори для трансформації клітин рослин
Хід лекції:
Вступна частина (до 5-6 хв)
Добрий день! Сьогодні ми продовжимо вивчати генетику мікроорганізмів. На сьогоднішній лекції ми поговоримо про вектори, які застосовують для трансформації мікроорганізмів.
Пригадайте які вектори ви вже вивчали на попередніх курсах.
Сьогодні ми з вами детальніше про них поговоримо.
Отже, тема нашої сьогоднішньої лекції: «Клонування. Вектори для клонування бактерій».
План:
1. Загальна характеристика векторів;
2. Характеристика плазмідних векторів;
3. Вектори на основі бактеріофага λ
4. Гібридні вектори;
5. Плазмідні вектори інших бактерій;
6. Вектори для трансформації клітин рослин
Основна частина (70-75 хв)
Клонування - поява природним шляхом або отримання декількох генетично ідентичних організмів шляхом безстатевого (у тому числі вегетативного) розмноження. Термін "клонування" в тому ж сенсі нерідко застосовують і по відношенню до клітин багатоклітинних організмів. (згадати що таке клон)
|
|
|
Молекулярне клонування - це технологія клонування найменших біологічних об'єктів - молекул ДНК, їх частин і навіть окремих генів. Для молекулярного клонування ДНК вводять в вектор (наприклад, бактеріальну плазміду або геном бактеріофага). Розмножуючись, бактерії і фаги багаторазово збільшують кількість введеної ДНК, в точності зберігаючи її структуру. Щоб потім виділити велику кількість такої ДНК, необхідно відокремити бактерії або фаги, які її містять, від всіх інших, для чого і застосовують клонування, тобто виділення та розмноження бактеріального або фагового клона, що містить необхідні молекули ДНК.
Загальна характеристика векторів
Вектор – молекула ДНК чи РНК, яка складається з двох компонентів: векторної частини (носія) і клонованого чужорідного гена. Завдання вектора – донести вибрану ДНК в клітину-реципієнт, вбудувати її в геном, дати можливість ідентифікувати трансформовані клітини, забезпечити стабільну експресію введеного гена.
Отже, вектор повинен бути невеликим, здатним підтримуватись в клітині-хазяїні (реплікуватися), багаторазово копіюватися (ампліфікуватися), експресувати відповідний ген (містити відповідні регуляторні послідовності), повинен мати маркерний ген, який дає змогу ідентифікувати гібридні клітини для ефективної селекції. Для забезпечення інтеграції чужорідної ДНК у векторній молекулі необхідна присутність сайтів розщеплення рестриктазами, які повинні бути локалізованими у ділянці, що є не суттєвою для реплікації векторної молекули. Будь-яка молекула ДНК, що має дані властивості може використовуватися як вектор. Такими векторами є плазміди, фаги або інші елементи. Вони використовуються для переміщення генів з одного організму до іншого. Векторна молекула повинна забезпечувати також стабільне успадкування гібридних молекул.
|
|
|
Крім того, реальні вектори повинні володіти ще цілим рядом властивостей в залежності з якою метою їх застосовують. Так дуже важливо, щоб вектор:
ü давав змогу здійснювати вставку чужорідної ДНК різної молекулярної маси;
ü щоб було можливим відрізняти клони бактерій, які несуть вихідні векторні та рекомбінантні молекули;
ü щоб вектор був невеликим за розмірами, бо з ним зручно працювати,
ü щоб вектор давав велике число копій на клітину, що в свою чергу полегшує виділення та очищення векторної та рекомбінантної молекул ДНК;
ü повинен мати якомога більше одиничних послідовностей, які розпізнаються різними рестриктазами.
|
|
|
Класифікують вектори за різними ознаками.
За застосуванням :
ü клонувальні – використовують для клонування будь-яких фрагментів ДНК;
ü експресійні– використовують для синтезу мРНК і білків;
ü спеціалізовані – використовують для секвенування і мутування генів, дослідження особливостей регуляції клонованих генів, ідентифікації в клонованій ДНК регуляторних ділянок, зокрема промоторів тощо.
За походженням:
ü плазмідні – здатні існувати у клітині і поза її межами у вигляді ДНК;
ü фагові (вірусні) – можуть існувати у вигляді ДНК і вібріонів;
ü гібридні – поєднують окремі властивості плазмід і вірусів.
За структурою: кільцеві та лінійні.
За способом підтримання у клітині:
ü автономні – реплікуються самостійно;
ü і нтегративні – реплікуються у складі клітинного генома.
За кількістю молекул у клітині:
ü однокопійні та низькокопійні – представлені в клітині 1-4 копіями;
ü висококопійні (мультикопійні) – представлені в клітині 10-100 копіями.
За кількістю реплікаторів у векторній молекулі:
ü монорепліконні – містять один сайт ініціації реплікації;
ü бірепліконні (човникові) або шатл-вектори – містять більше одного сайта ініціації реплікації.
Характеристика плазмідних векторів
Плазмідний вектор pSC 101
Це перша векторна плазміда, вона була виділена у 1973 році у лабораторії С. Коена. Плазміда має 9,1 т.п.н., знаходиться під строгим контролем реплікації, детермінує стійкість до тетрацикліну і має точку рестрикції EcoR1, що знаходить не в ділянці гена стійкості до тетрацикліну (tet). Крім того, на ДНК даної плазміди у гені tet є точки рестрикції HindIII , BamHI, SalI.
Плазміда pSC101 як клонуючий вектор має ряд недоліків. По-перше, при інтеграції чужорідної ДНК у точку рестрикції EcoR1 звичайно не вдається фенотипово розрізнити клони трансформантів від клітин без векторів. (Чому?)
По-друге, при інтеграції чужорідної ДНК у точки рестрикції HindIII , BamHI SalI порушується ген tet , і клони, маючи гібридні плазміди, будуть мати фенотип Tcs , як і вихідні клітини. По-третє, pSC101 має строгий контроль реплікації і знаходиться у клітині приблизно у шістьох копіях. Через перелічені недоліки дана плазміда використовувалась в генній інженерії лише на початку, до появи більш досконалих векторів на основі інших плазмід.
Плазмідний вектор pBR 322
У 80-ті роки вектор був одним з найпопулярніших універсальних векторів. Звичайно назва вектора включає букву р (від англ. plasmid) і ще декілька букв, що мають відношення до опису вектора чи історії його створення. Так, букви BR в назві плазміди означають авторів Ф. Болівара та Р. Родрігеса, що сконструювали цю плазміду, а число 322 – цифрове значення, взяте з їх дослідницьких протоколів. Довжина плазміди становить 4361 п.н. Вона несе два гени (селективні маркери) стійкості до антибіотиків: ампіціліну та тетрацикліну, а також унікальні сайти для BamHI, HindIII та SalI. Плазміда реплікується з утворенням великої кількості копій, в інші бактеріальні клітини переноситься важко.
Якщо очищену кільцеву плазміду pBR322 обробити рестриктазою, що розщеплює її в єдиному сайті, розміщеному в одному з генів стійкості до того чи іншого антибіотику, то утворюється лінійна молекула з “липкими кінцями”. Такі молекули змішують з донорською ДНК, що містить необхідний ген і попередньо оброблений тією ж рестриктазою. Оскільки липкі кінці цих двох ДНК взаємно комплементарні, вони спарюються з утворенням гібридних молекул. Далі суміш обробляють ДНК–лігазою фага Т4 в присутності АТФ, в результаті чого утворюється різні комбінації фрагментів, а також небажані продукти. Щоб зменшити кількість останніх, обробляють рестрикційну плазмідну ДНК лужною фосфатазою.
При трансфекції клітин штаму E . coli К12 плазмідою pBR322 може утворюватися більше 108 успішно трансформованих клітин на 1 мкг плазмідної ДНК в залежності від штаму, що використовується та умов. Після проникнення сегментів ДНК у вектор pBR322 in vitro ефективність трансформації знижується на один або два порядки, що знову ж таки визначається штамом-господарем та умовами.
Клітини E . coli К12, які містять pBR322 культивують у середовищі, яке містить ампіцилін або тетрациклін чи обидва антибіотики. При цьому клітини що втратили плазміду не ростуть в присутності будь-якого з АБ. Якщо будь-який сегмент ДНК проникає у ділянку плазміди, яка кодує стійкість до тетрацикліну (наприклад у сайт рестрикції для BamH1, Sal1), тоді трансформанти зберігають властивість рости у середовищі із ампіциліном, але не ростуть у середовищі з тетрацикліном, якщо вставка відбувається у ампіциліновому гені (у сайтах рестрикції PvuІчи PstІ), то спостерігається зворотна ситуація.
Експерименти проведені Гілбертом для отримання інсуліну були здійснені саме з використанням плазміди pBR322. Ідея використовувати pBR322 як вектор для клонування була повністю вдалою, але ця плазміда містить лише декілька сайтів рестрикції, а відбір трансформованих клітин займає багато часу. Це привело до необхідності розробки альтернативних систем клонування.
Плазмідний вектор pUC 19
Ідея використовувати pBR322 як вектор для клонування була повністю вдалою, але ця плазміда містить лише декілька сайтів рестрикції, а відбір трансформованих клітин займає багато часу. Це призвело до необхідності розробки альтернативних систем клонування. Наприклад, плазміда pUC19 довжиною 2686 т.п.н. містить: ген стійкості до ампмціліну; регулюючий сегмент гена β – галактозидази (lac Z), лактозного оперону E . coli, ген lac І, кодуючий репресор, який контролює експресію гена lac Z , полілінкер – коротку послідовність з багатьма унікальними сайтами, що впізнають ендонуклеази (EcoRI, SacI , KpnI , XmaI , SmaI , BamHI , XdaI , SaI , l HincII , PstI , HindIII); точку реплікації плазміди pBR322.
Для клонування в pUC19 донорну ДНК розрізають одною з рестриктаз, сайт якої знаходиться у полілінкері; плазмідну ДНК гідролізують такою ж рестриктазою, а потім обробляють лужною фосфатазою. Дві ДНК змішують у присутності ДНК-лігази Т4 і використовують одержаний продукт для трансформації клітин, які здатні синтезувати не активну β-галактозидазу. Оброблені клітини висівають на поживне середовище з ампіциліном і субстратом для β-галактозидази. Не трансформовані клітини не здатні рости у присутності ампіциліну, а клітини, що мають інтактну плазміду, утворюють колонії синього кольору. Клітини-господарі, що мають гібридну плазміду, утворюють на цьому середовищі колонії білого забарвлення.
Вектори на основі бактеріофага λ
За допомогою плазмідних векторів можна клонувати фрагменти довжиною до 10 т.п.н. Однак при створенні геномних бібліотек часто працюють з великими фрагментами. Тому були розроблені вектори на основі бактеріофага λ E . coli .
Вектори на основі бактеріофага λ мають більшу ємність, в них можна клонувати фрагменти ДНК завдовжки від 5 до 25 т.п.н. і їх легко ідентифікувати за утворенням бляшок на чашці після проходження циклу літичної дії.
Розмір ДНК фага λ становить біля 50 т.п.н, значна його частина (біля 20 т.п.н.) несуттєва для розмноження фага і відповідає за його вмонтування у ДНК господаря. У зв’язку з цим виникла ідея, що її можна замінити фрагментом іншої ДНК еквівалентного розміру. Утворена молекула буде реплікуватись у клітині як ДНК “рекомбінантного”фага λ.
Відмінності між плазмідними та фаговими векторами:
1. при використанні фагових векторів життєздатним продуктом, що містить рекомбінантну ДНК, є популяція вібріонів бактеріофага.
2. не потрібно проводити клонування і відбір клітин, які містять вектор, - рекомбінантний фаговий геном можна клонувати безпосередньо (на газоні чутливих клітин утворюються бляшки).
3. рекомбінантні фагові геноми можна внести в клітини хазяїна шляхом трансфекції (ізольованої ДНК) чи інфекції (у складі реконструйованих вірусних часток).
4. фагові вектори більш ефективні, ніж плазмідні, для клонування великих вставок.
5. виявляти потрібну вставку з негативних колоній фага легше, ніж з бактеріальних колоній.
Фагові вектори поділяють на: вектори включення – несуть один сайт для обраної рестриктази і їх довжини дорівнюють сумі довжин вектора і вставки; вектори заміщення – несуть два сайти для обраної рестриктази; фрагмент ДНК, який клонується, вбудовується замість обмеженого цими сайтами буферного (баласного) фрагмента. Геном фага лябмда містить по кілька сайтів розпізнавання для майже кожної із ендонуклеаз рестрикції, які широко використовуються. Під час розробки векторів ці ділянки вилучають, і залишають тільки одну (у векторах включення, λ gt10) або дві (у векторах заміщення, наприклад λ EMBL4).
Щоб зрозуміти, як функціонує векторна система на основі фага λ, необхідно розглянути молекулярні аспекти літичного циклу розвитку. Інфекційна фагова частинка має головку, в якій упакована ДНК, довжиною 50 т.п.н., і відросток, від якого відходять тонкі білкові нитки. ДНК фага λ – це лінійна дволанцюгова молекула довжиною 50 т.п.н, що має “липкі кінці”, вони взаємокомплементарні і можуть взаємодіяти між собою. Після того, як фагова ДНК проходить через відросток і попадає в клітину, cos-кінці з’єднуються і утворюють кільцеву молекулу. На ранньому етапі літичного циклу в результаті реплікації кільцевої молекули ДНК утворюється лінійна молекула довжиною 50 т.п.н. Кожний з таких сегментів упаковується у білкову головку, до останньої приєднується вже готовий відросток і утворюється нова фагова частинка. При упакуванні молекули ДНК довжиною менше 38 т.п.н. утворюється неінфекційна фагова частинка, а фрагменти довжиною більш ніж 52 т.п.н. не поміщаються у головку. Сегменти довжиною 50 т.п.н. в лінійній молекулі ДНК розділені со s – ділянками, саме у цих ділянках розрізається молекула, коли фрагменти заповнюють головку.
У результаті досліджень з вивчення функціонування фага λ була розроблена система упакування молекули ДНК in vitro з утворення інфекційної фагової частинки. Змішавши у пробірці очищені порожні головки, фагову ДНК і відростки, можна отримати інфекційні фагові частинки.
Один із багатьох λ–векторів для клонування має два BamHI – сайти, фланковані ділянки довжиною 20 т.п.н. При гідролізі очищеної фагової ДНК рестриктазою BamHI утворюється три фрагменти. Так зване ліве плече містить генетичну інформацію про головку і відросток фага, праве плече – про реплікацію ДНК і лізис, а середній сегмент має гени, що відповідають за процеси інтеграції і включення. Задача дослідника полягає в тому, щоб замінити цей середній фрагмент довжиною приблизно 20 т.п.н. потрібною ДНК. ДНК, призначену для клонування, також розщеплюють за допомогою рестриктаз і виділяють фрагменти розміром від 15 до 20 т.п.н. Обидва препарати – фагова і чужорідна ДНК – об’єднюють і додають ДНК–лігазу фага Т4, а далі – порожні головки і відростки. Фрагменти більше 52 т.п.н. і менше 38 т.п.н. розміру упакуватися не можуть. Рекомбінантний фаг λ може розмножуватися тільки в тих штамах E . coli, які не забезпечують розмноження фага λ. Для зберігання рекомбінантного фага λ його періодично пересівають на свіжу культуру E . coli .
Для різних завдань було сконструйовано багато різних λ-векторів Усі вони характеризуються двома основними властивостями:
v самі векторні молекули можуть розмножуватися подібно до фага у процесі літичної інфекції, що дає змогу отримати векторну ДНК.
v строго фіксоване розташування сайтів рестрикції дає змогу здійснювати “розрізання” чи видалення центральної несуттєвої ділянки, а також отримати сайти для лігування вставки.
У багатьох векторів, які сконструйовані на основі ДНК фагa λ використовують не EcoRІ, а інші сайти рестрикції, які дають змогу отримувати потрібні плечові фрагменти та провести лігування з різноманітними вставками. Ті вектори у яких повністю делетована несуттєва ділянка геному можуть включати вставки максимального розміру – більше 24 т.п. н.
Гібридні вектори
Косміди
Косміди – це один з типів гібридних векторів, які реплікуються використовуючи плазмідний тип реплікації та здатні упаковуватися in vitro у головки фага λ, бо містять cos -сайти фага, які розташовуються на кінцях ДНК і оскільки вони розпізнаються специфічними ферментами, які відрізають молекули ДНК певної довжини по цих сайтах, то фактично забезпечують упаковування ДНК у голівки фага. Косміди, можуть включати 40 т.п.н. чужорідної ДНК і при цьому активно ампліфікуються в E . coli як плазміди.
Типова косміда володіє здатністю до реплікації, містить унікальні ендонуклеазні сайти і селективні маркери, які належать плазмідній ДНК, об'єднаній з сегментом ДНК фага λ (конкатамером), що містить з’єднані липкі кінці (со s -сайти). Косміди конструюють за допомогою методів, які використовуються при роботі з рекомбінантними ДНК. При розщепленні конкатемерної ДНК фага λ за допомогою відповідних ендонуклеаз утворюються соs-ділянки, що можуть бути включені в стандартний плазмідний вектор.
Важливою особливістю більшості космідних векторів для клонування є їх здатність включати вставки ДНК розміром до 45 т.п.н. Якщо кільцеву космідну ДНК розрізати по якомусь унікальному сайту, змішати з фрагментами ДНК, що містять відповідні липкі кінці і провести гібридизацію, то утворюються довгі конкатамери. При змішуванні цих конкатамерів з білками, що здійснюють упаковку ДНК фага λ, вони розрізаються по со s-сайтах і ДНК упаковується звичайним шляхом. Цей процес дозволяє відібрати вставки великої довжини, оскільки для того, щоб ДНК могла упакуватися в головки фага λ, відстань між со s-сайтами повинна складати від 38 до 52 т.п.н. Як і у випадку з λ-векторами, суміш конкатамерів є складною і часто містить векторні фрагменти без всяких вставок або з безліччю вставок, що повторюються.
Реципієнтні клітини-господарі отримують упаковані косміди в результаті інфікування «фальшивими» фаговими частинками, причому цей процес значно ефективніший, ніж трансфекція плазмідною ДНК. На 1 мкг ДНК зі вставками можна отримати від 1×104 до 5×105 колоній трансформованих клітин. Потрапивши в клітину-господар, рекомбінантна ДНК ампліфікується і зберігається у вигляді плазміди
Косміди мають більше переваг, ніж плазміди: в них можна вмонтувати більшу ділянку ДНК, а це означає, що для створення геномної бібліотеки потрібно менше число клонів і менше часу на їх скринінг.
Фазміди
При вивчені геномних клонотек зручно використовувати фазміди – молекулярні вектори, що є штучними гібридами між фагом і плазмідою. Фазміди після вмонтування чужорідної ДНК можуть в одних випадках розвиватись як фаги, в інших – як плазміди.
Максимальний розмір фрагментів, які можна клонувати у фазмідах, становить до 50 т.п.н. Фазміду виділяють із клітини у вигляді плазміди, гідролізують відповідною рестриктазою і лігують з продуктами неповного гідролізу досліджуваної ДНК, після чого проводять упакування ДНК у капсид фага λ.
Фазміди - це лінійні дуплексні молекули ДНК фага λ, які містять всі гени необхідні для літичного розвитку, а середня частина містить лінеаризовану плазміду. Функції реплікації як фага, так і плазміди у фазмідах повністю збережені. Зазвичай вектор містить декілька тандемних повторів плазмідного сегмента, які забезпечують необхідну для успішної упаковки ДНK довжину генома. Подібно рекомбінантам фага λ і космідам фазмідні ДНК упаковуються in vitro перед інфекцією. Потрапляючи у клітину E . col і, фазміда реплікується як фагова ДНК, у результаті чого на газоні чутливих бактерій утворюються бляшки. Проте, якщо вектор містить ген, що кодує репресор фага λ, тоді фазміда реплікується як плазміда, а не як фаг. Крім цього якщо ген-репресор кодує мутантний білок сІ, який інактивується при підвищеній температурі (температурочутливий репресор), то фазміда реплікується як плазміда при низькій температурі, і як фаг при підвищеній температурі на декілька градусів. Таким чином, фазміди є векторами, що забезпечують можливість зміни фаз, тобто експерементально регулюючого переключення розвитку гібридних ДНК на фаговий чи плазмідний шлях.
Така маневреність може виявитися надзвичайно корисною у біотехнологічних процесах і генетичному конструюванні.
Фазміди мають ряд переваг порівняно з іншимим видами векторів. На відміну від них, не має необхідності відділяти векторну молекулу ДНК від внутрішнього баластного фрагмента. Більш того, це запезпечує повну відсутність у фазміді “фонових” гібридів, які зазвичай утворюються у фагових векторів, так як дуже важко повністю знищити фрагмент, який потрібно замінити.
Дата добавления: 2022-01-22; просмотров: 36; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!