Плазмідні вектори інших бактерій
Бактерії роду Pseudomonas широко поширені у природі і можуть знайти застосування у різних біотехнологічних процесах. Вони характеризуються великим різноманіттям катаболітних шляхів. Цей рід об’єднує біля 30 видів, серед яких поряд з ґрунтовими непатогенними бактеріями є фітопатогенні та патогенні для людини і тварин види. Наявність у них плазмід, які мають гени біодеградації різноманітних органічних сполук, включаючи такі, які не зустрічаються у природі (інсектициди, гербіциди), робить перспективним використання бактерій даного роду для розробки технологій, які направлені на охорону навколишнього середовища. Деякі види бактерій роду Pseudomonas здатні утилізувати 100 і більше різноманітних субстратів.
Найбільш вивченими є два представники цього роду: P . aeruginosa (штам РАО) та P . putida . Деякі види, такі як P . putida , P . alcaligenes здатні до трансформації. Оскільки проміжним господарем з рекомбінантною ДНК є клітини E . coli, то ефективним шляхом введення гібридних плазмід у Pseudomonas є коньюгація. Гени E . coli як правило ефективно експресуються у Pseudomonas . Гени біосинтезу амінокислот E . coli комплементують відповідні ауксотрофні мутації штамів P . putida та P . aeruginosa .
Навпаки, ефективність експресії генів Pseudomonas є надзвичайно низькою або відсутня у клітинах E . coli . Рівень активності ферментів, які кодуються TOL-плазмідою у E . coli складає 1-2 % від рівня P . putida , а швидкість росту E . coli на толуолі як єдиному джерелі вуглецю в цьому випадку у 10 раз нижча, ніж у P . putida. Це важливо враховувати при клонуванні генів Pseudomonas .
|
|
|
Геном актиноміцетів організований складніше, ніж у інших бактерій і перевищує розміри генома E . coli приблизно у три рази. Інша відмінна риса це високий вміст GC пар у їх ДНК (досягає 73%). З практичної точки зору актиноміцети важливі тим, що, наприклад, більше 70% усіх відомих антибіотиків продукується родом бактерій Streptomyces.
Виробництво антибіотиків є найбільшою галуззю в промисловій мікробіології. Найбільш генетично вивченими серед актиноміцетів є Streptomyces coelicolor A3(2) і S . lividans 66. Застосування методів молекулярного клонування для актиноміцетів стало можливим завдяки розробці ефективних способів отримання протопластів і трансфекції фаговою ДНК.
Для трансформації та трансфекції протопласти і ДНК змішують. На ефективність проникнення ДНК у клітини впливає багато факторів: температура вирощування та ріст міцелію, концентрація літичних ферментів, іонів Ca2+ та Mg2+, сахарози.
Для актиноміцетів розроблені як плазмідні, так і фагові вектори.
Плазмідні вектори створені на основі плазмід актиноміцетів
Плазміда SLPI .2 була виділена з S . lividans та за розміром становила 14,5 т.п.н. і була вперше використаною плазмідою. Плазміди серії SLPI .2 обумовлюють коньюгаційний процес і перебувають у клітині в невеликій кількості копій. Як селекційні маркери вони містять гени, що є стійкими до таких антибіотиків: неоміцину (aph), тіострептону (tsr) та віоміцину (vph). Недоліком плазмід цієї серії є вузький спектр господарів, що залежить від наявності у хромосомах багатьох видів актиноміцетів послідовностей, які є спорідненими до плазміди SLPI .2.
|
|
|
Друга серія векторів створена на основі статевої плазміди Streptomyces coelicolor A3(2) – SCP 2 (31т.п.н). Ця плазміда була ізольована із актиноміцетів і достатньо добре вивчена.
Чужорідні гени клонують у так званих човникових векторах. Ці вектори з однаковим успіхом реплікуються в клітинах декількох господарів, наприклад, у клітинах E. coli і B. subtilis. Вектори були отримані рекомбінацією in vitrо фрагментів плазмід, виділених з обидвох видів. Для конструювання рекомбінантної ДНК, що містить у своєму складі ген, який повинен експресуватися, дотримуються наступної стратегії. Синтезують кДНК або виділяють з клонотеки клітини, що несуть фрагмент генома з потрібним геном, і клонують їх у відповідному векторі. Фрагменти ДНК генома піддають модифікації – видаляють з них некодуючі ділянки і ділянки сусідніх генів. Часто для проведення цієї операції необхідне секвенування даного фрагмента ДНК. Потім конструюється проміжна рекомбінантна ДНК, в якій ген поміщається під контроль бактерійних регуляторних елементів (промотор, оператор, точка зв'язування з рибосомами). Ці регуляторні елементи виділяють з гібридних плазмід, сконструйованих спеціально як джерела регуляторних елементів. Отримана конструкція вбудовується у відповідний вектор, наприклад, p BR 322, і ген експресується в бактерійній клітині.
|
|
|
Проте зручніше вбудовувати ген в спеціальний вектор для експресії, який вже містить регуляторні елементи, що забезпечують активну експресію після введення рекомбнантної плазміди в клітину До таких ефективних регуляторних ділянок належить, наприклад, сильний промотор гена β-галактозидази, ген стійкості до пеніциліну, що входить до складу плазміди pBR322, промотор інсуліну, вбудований в сайт рестрикції Pst I, який розташований в структурній частині гена. Промотор гена інсуліну забезпечує ефективну транскрипцію, яка триває до тих пір, поки РНК-полімераза не дійде до сигналу термінації вбудованого гена.
Дата добавления: 2022-01-22; просмотров: 27; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!