Создание трансгенных растений. Маркерные гены.
Создание трансгенных растений. Еще 10 лет тому назад биотехнология растений заметно
отставала в своем развитии, но за последние 3 года наблюдается быстрый выброс на рынок
трансгенных растений с новыми полезными признаками.
Трансгенные растения в США в 1996 году занимали площадь 3 млн. акров, в 1997 году
площадь увеличилась до 15 млн. акров, в 1998 году до 60 млн. акров, а в прошлом году до 80
млн. акров.
Отсчт истории генетической инженерии растений принято вести с 1982 года, когда впервые
были получены генетически трансформированные растения.Метод трансформации
основывается на природной способности бактерий Agrobacteriumtumefaciens генетически
модифицировать растения. Реконструированные штаммы Agrobactrium, содержащие
неонкогенные варианты Ti- плазмид и обладаю щие повышенной вирулентностью, стали
основой одного из наболее популярных методов трансформации.
Генетические изменнные растения с устойчивостью к различным классам гербицидов в
настоящее время являются наиболее успешным биотехнологическим продуктом. Дело в том,
что биотехнология позволила совершить такой прыжок, так как оказалось возможным
генетически изменять устойчивость растений к тем или иным гербицидам либо путем
введения генов, кодирующих белки, нечувствительные к данному классу гербицидов, либо за
счет введения генов, обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов растений.
К настоящему времени клонированы гены, кодирующие нечувствительные к действию
|
|
|
гербицидов ферменты-мишени, что дало возможность получать трансгенные растения,
устойчивые к таким гербицидам, как глифостат и хлорсульфуроновым, и имидазолиноновым
гербицидом.
Изолированы также гены, которые кодируют ферменты деградации некоторых гербицидов,
что позволило получить трансгенные растения устойчивые к фосфинотрицину и далапону. В
1997 году устойчивая к Roundup соя, распространяемая компанией AsGrow, была признана в
США сельскохозяйственным продуктом года. Ученые пошли далее. Так как множество
растений подвержены нападению и поеданию со стороны насекомых, то ученые генной
инженерии провели эксперимент с давно известной бактерией Bacillus-Thiringiensis, которая
продуцирует белок, оказалось она является очень токсичной для многих видов насекомых, но
в то же время безопасна для млекопитающих белок дельта-эндотаксин, CRY-белок
продуцируется различными штамамиBacillus- Thiringiensis.
Так, например, с помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к
колорадскому жуку.
Можно выделить 2 группы маркерных генов, позволяющие отличить трансформированные
клетки:
1. Селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам (канамицину,
|
|
|
тетрациклину, неомицину и др.), гербицидам (у растений). Это могут быть гены
ауксотрофности по какому-либо субстрату и т.д. Основной принцип работы такого маркера –
способность трансформированных клеток расти на селективной питательной среде, с
добавкой определенных веществ, ингибирующих рост и деление нетрансформированных,
нормальных клеток.
2. Репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях
может быть легко тестировано.
Чаще всего в качестве репортерных используются гены β-глюкуронидазы (GUS), зеленого
флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). К
настоящему времени из этого арсенала наиболее часто используют гены GUS и GFP и, в
меньшей степени, LUC и CAT. Используемый в настоящее время как репортерный ген GUS
является модифицированным геном из Escherichiacoli, кодирующим β-глюкуронидазу с
молекулярной массой 68 кД. GUS активен в широком диапазоне условий среды с оптимумом
при рН 5-8 и 37°С. Он может гидролизовать обширный спектр природных и синтетических
глюкуронидов, что позволяет подбирать соответствующие субстраты для
спектрофотометрического или флюориметрического определения активности фермента, а
|
|
|
также для гистохимического окрашивания тканей insitu (например, в синий цвет). Фермент
достаточно стабилен: он устойчив к нагреванию (время полужизни при 55°С составляет около
2 ч) и к действию детергентов. В процессе замораживания-оттаивания потери активности GUS
не происходит. В составе химерных белков, созданных генно-инженерными методами, GUS
обычно сохраняет свою функциональную активность. В живых клетках белок GUS также
весьма стабилен и активен от нескольких часов до нескольких суток.
GFP (greenfluorescentprotein - зеленый флюоресцентный белок, или белок зеленой
флюоресценции) был обнаружен Shimomura с соавт. в 1962 г. у люминесцирующей медузы
Aequoreavictoria. Ген GFP был клонирован в 1992 г. Prasher и соавт., и уже через несколько лет
началось активное использование этого гена как репортерного в работах с самыми разными
про- и эукариотическими организмами. В настоящее время ген GFP применяется в сотнях
работ во всем мире, и число их стремительно нарастает. Столь быстрый рост вызван особыми
свойствами белка GFP, а именно его способностью флюоресцировать в видимой (зеленой)
области спектра при облучении длинноволновым УФ. Эта флюоресценция обусловлена
непосредственно белком, для ее проявления не требуется субстратов или кофакторов.
Благодаря этому свойству ген GFP является очень перспективным репортерным геном,
позволяющим проводить разнообразные прижизненные (недеструктивные) исследования с
трансгенными организмами.
Дата добавления: 2018-02-18; просмотров: 761; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!