Индукция каллуса. Морфогенез в культуре тканей растений.
КБР
БИЛЕТ 3
1. Культивируемые клетки растений как объект биотехнологии
Объектам исследования клеточной биотехнологии растений является клеточная культура.
Культуры клеток высших растений имеют две сферы применения: 1.Изучение биологии клетки, существующей вне организма, обуславливает ведущую роль клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений. Популяциям растительных клеток присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференцированной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции идет размножение клеток, фенотип и генотип которых соответствуют данным условиям выращивания, следовательно, популяция эволюционирует. Все это позволяет считать, что культуры клеток являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока мало изучены. Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения.
2. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.
|
|
|
Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:
1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения.
2. Ускоренное клональноемикроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.
3. Получение безвирусных растений.
4. Эмбриокультура и оплодотворение invitro часто применяются для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша, для получения растений после отдаленной гибридизации
5. Антерные культуры – культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.
6. . Клеточный мутагенез и селекция. Криоконсервация и другие методы сохранения генофонда.
7. Иммобилизация растительных клеток.
8. Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.
9. .Конструирование клеток путем введения различных клеточных оганелл.
10. .Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.
|
|
|
11. Изучение системы «хозяин – паразит» с использованием вирусов, бактерий, грибов и насекомых).
Некоторые аспекты в регуляции морфогенеза: дифференциация клеток, тотипотентность, компетентность и детерминация клеток
Морфогене́з (англ. morphogenesis, от др.-греч. μορφήʻформаʼ и γένεσιςʻвозникновениеʼ, или буквально «формообразование») — возникновение и развитие органов, систем и частей тела организмов как в индивидуальном (онтогенез), так и в историческом, или эволюционном, развитии (филогенез). Культивируемые клетки и ткани растений обладают свойством тотипотентности – способностью из одной клетки формировать целые растения. Дифференциация целых растений в культуре клеток и тканей может происходить посредством различных путей: органогенеза (формирование почек и корней) или соматического эмбриогенеза.
При культивировании тканей растений на таких средах многие клетки оказываются способными к неограниченному размножению, образуя слои (массу) недифференцированных клеток, получивших названиекаллуса. Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших растений - корней, листьев, стеблей, пыльников, зародышей (экспланты) помещают на искусственную среду, содержащую ауксины, в пробирки, колбы, чашки Петри (invitro).
|
|
|
Каллус – группа дедифференцированных клеток, возникших invivoилиinvitroпутем неорганизованной пролиферации. Культура каллусов invitro– выращивание в длительности.
Дедифференциация – переход специализированных клеток к пролифирации и неорганизованному каллусному росту (утрата клетками специализации).
Редифференциация – переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно. Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между клетками. Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее их от других
Процессу образования каллуса предшествует дедифференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток.
Клетки в культуре могут существовать в двух видах: в виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой питательной среды в виде каллуса.
Возникновение физиологических и структурных различий между клетками и тканями растений, связанное с их функциональной специализацией, называют процессом дифференциации. Понятие «дифференциация» отражает превращение эмбриональной, меристематической клетки в специализированную. Меристематические клетки, однотипные по структуре и функции, начинают развиваться различными путями, создавая ткани разных органов. Если затем каллус разделить на отдельные клетки и продолжить культивирование изолированных клеток на питательных средах, то из отдельных (одиночных) клеток могут развиться настоящие растения. Регенерация–восстановление целостного организма из клетки, ткани, органа. Способность одиночных соматических клеток растений развиваться в настоящее (целое) растение, называют тотипотентностью.
|
|
|
3. Культура растительных клеток как объект генетической трансформации.
Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены (их называют "трансгенами") из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией. Основными преимуществами такой технологии по сравнению с традиционной селекцией являются: возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип; возможность придания признаков, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами; значительное ускорение процесса получения новых генотипов. Наиболее широко используемый метод трансформации - агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная бактерия Agrobacteriumtumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли - корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, нужные человеку. Впоследствии был разработан ряд других методов трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, нечувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток мишени.
Билет 4
Индукция каллуса. Морфогенез в культуре тканей растений.
Исследовано влияние гормонального состава питательной среды, времени введения эксплантов в культуру invitro и типа экспланта (лист, стебель, черешок) на индукцию каллусогенеза в культуре изолированных органов у душицы обыкновенной (Origanumvulgare L.). Определен оптимальный режим получения асептических культур из семян, сегментов листа, стебля и черешка последовательная обработка 70 %-ным этанолом (1 мин) и 50 %-ным «Брадофеном» (4 мин). Показано, что максимальная частота каллусогенеза (до 85 %) наблюдалась при использовании среды Мурасиге и Скуга, дополненной 1,0 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л 6-БАП. На большинстве испытанных сред частота каллусогенеза выше при культивировании сегментов черешка листа по сравнению с эксплантами листа и стебля. Установлено, что при помещении на питательные среды эксплантов в весенний и зимний периоды частота каллусогенеза была в 2-4 раза больше по сравнению с летним.
Существует несколько путей, по которым может пойти каллусная клетка после ее дедифференцировки: 1) вторичная регенерация целого растения, возможна дифференцировка на уровне клеток, тканей, органов; 2) утрата способности к вторичной дифференцировке и регенерации растений, стойкая дедифференцировка, приобретение способности расти без гормонов - опухолевая (это явление чаще наблюдается у старых культур); 3) нормальный онтогенез каллусной клетки, заканчивающийся ее старением и умиранием. Клетка претерпевает вторичную дифференцировку и прекращает делиться (стационарная фаза). Интереснее регенерация. В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток. Существуют различные типы морфогенеза: органогенез - корневой, стеблевой, флоральный, листовой; соматический эмбриогенез (образование зародышеподобных структур из соматических клеток). В случае органогенеза сначала регенерируют отдельные органы, а затем уже из них - целые растения, исключение - корневой органогенез . В отличие от органогенеза при соматическом эмбриогенезе сразу образуется биполярная структура (соматический зародыш), имеющая зачаточный корешок и стеблевую почку, из которой развивается растение.
Тотипотентность - это способность любой клетки воспроизвести целое растение. Любая растительная клетка содержит весь набор генов и сохраняет свойственную зиготе программу развития любого органа: лист, лепесток, сердцевинная паренхима и т.п. Однако возможности разных типов клеток различны, свойство тотипотентности не всегда реализуется. В некоторых клетках гены в сильной степени репрессированы. В организме тотипотентность не проявляется, так как организм подавляет потенциал развития отдельной клетки, изоляция способствует проявлению этих потенций. Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференцировка. Регенерация растений начинается с вторичнойдедифференцировки. При этом дедифференцированные клетки вновь приобретают структуру и функции специализированных. Большая роль в этом процессе принадлежит фитогормонам. Они вызывают изменение метаболизма клеток. Вторичная дифференцировка каллусных клеток не всегда заканчивается морфогенезоим и регенерацией растений. Иногда это гистодифференцировка. Таким путем клетка каллуса может превращаться во флоэмные и ксилемные элементы, из активной клетки в старую. Для управления морфогенезом используются внешние и внутренние факторы: внутренние - вид растения, генотип, орган, из которого взят эксплант; внешние - состав питательной среды, температура, свет (интенсивность, спектр, длина фотопериода).
Сигналом (импульсом) морфогенеза является изменение соотношения цитокининов и ауксинов, т.е. они не только регуляторы роста, но и дифференцировки. Эмбриогенез фактически не зависит от гормонов. Обычно эмбриогенные зоны возникают в каллусной ткани на той же питательной среде, на которой шло каллусообразование. Развитие соматических зародышей в каллус-ной ткани начинается тогда, когда устраняется дедифференцирующий фактор из питательной среды. Развивающийся зародыш не нуждается в экзогенных гормонах. Дополнительные стимулы морфогенеза - азотнокислое серебро, нитрат аммония, некоторые аминокислоты (пролин, тирозин, иногда серин), полиамины (путресцин и спермидин). В ряде случаев стимулируют морфогенез маннит и сорбит. Ионы окиси азота влияют на развитие возникающих в каллусной ткани организованных структур, а их индукцию стимулируют ионы аммония - NH4. Гибберелловая кислота способствует росту зачатков стебля, а абсцизовая - ускоряет дифференциацию органов соматических зародышей. Азотнокислое серебро продлевает регенерационную способность в старых пересадочных культурах. Лишь одна из 400-1 000 клеток регенерирует. Одного стимула недостаточно, необходима еще готовность к нему. Способность воспринимать стимулы морфогенеза определяется как компетентность клетки.
2. Получение соматических гибридов методом слияния изолированных протопластов. Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце прошлого века. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как в 1960 г. И. К. Коккинг впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты. В настоящее время продолжается разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопластов на искусственных питательных средах. Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС12. В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений-реге-нерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур. Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой. Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Коккинга в 1970 г. его сотрудниками Пауэром и др. В качестве индуктора они использовали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким рН (9–11) и высокой концентрацией ионов кальция (100–300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500–6000. У. Циммерман с сотрудниками.разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока. Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного. Это возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер, и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения. Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам. Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotianaglauca и N. Langsdorfii. В настоящее время методом парасексуальной гибридизации получено большое число межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Примером может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением- монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности. Особый интерес представляют межцарственные клеточные гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др. При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, используются большие популяции клеток обоих родителей. При обработке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, вдальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача – выделить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами. Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови. Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическаякомплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплементацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светоза-висимуюхлорофилльную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету. Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия. Например, половые гибриды между N. glauca и N. Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях invitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в основу метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции соматических гибридов: смешанная физиологогенетическаякомплементация, физическое обогащение (метод основан на разделении протопластов при центрифугировании в связи с их различной плотностью), механическая изоляция. Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты. Из этих протопластов Карлсон получил растения-регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма. Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только начинают развиваться. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки, как мы видим, открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией
Дата добавления: 2018-02-18; просмотров: 2862; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!