Постановка хронического эксперимента для определения лимитирующего критерия вредности
Микроорганизмы-продуценты вводят животным интраназально в виде суспензии в физиологическом растворе с последующим пересчетом вводимой дозы на концентрацию клеток во вдыхаемом воздухе (Прил.2). При наличии специальных камер для создания микробных аэрозолей проводят ингаляционное введение. При нормировании микроорганизмов-продуцентов в воде водоемов используют энтеральное введение. При исследовании готовых форм препаратов на основе живых микроорганизмов используют ингаляционное введение в пылевых затравочных камерах, при этом ежедневная экспозиция при установлении ПДК в воздухе рабочей зоны - 4 ч, а для ПДК в атмосферном воздухе - круглосуточно. Энтеральное и интраназальное введение осуществляют 1 раз в сутки.
Для определения порогов иммунотоксического и дисбиотического действия введение живой культуры микроорганизма-продуцента или готовой формы препарата осуществляют в течение 1 месяца. Длительность периода ингаляционного воздействия готовой формы препарата при установлении порога хронического общетоксического действия (Lim 
) - 4 месяца.
Определение порога иммунотоксического действия
Иммунотоксическое действие может проявляться сенсибилизацией, иммунизацией (признак антигенности микроорганизма) и неспецифической иммуномодуляцией (стимуляция и иммунодефицит) организма, поэтому в настоящем документе предусмотрено определение всех трех возможных иммунотоксических эффектов.
|
|
|
Для оценки опасности развития сенсибилизации в хроническом эксперименте тестирование животных осуществляют живой культурой микроорганизма-продуцента. Аллергены из микроорганизмов используют только при наличии коммерческих препаратов, прошедших государственный контроль, т.е. с гарантированной специфичностью и активностью. При оценке готовых форм препаратов, кроме того, применяют их суспензию и растворы (взвеси) отдельных химических соединений. С микроорганизмами выполняют определение ГЗТ и ГНТ, с химическими соединениями - тесты, указанные в разделе 3.2.
Определение гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ):
тестирование животных опытной (сенсибилизированной) и контрольной (интактной) групп проводят путем введения под аноневроз задней лапки взвеси микроорганизма-продуцента (в объеме 0,05 мл), выращенного на оптимальной плотной питательной среде и суспензированного в физиологическом растворе, в концентрации, которая у контрольных животных не вызывает воспалительной реакции. При оценке готовой формы препарата второй партии животных опытных групп вводят 100 мкг наполнителя. На следующие сутки (через 18-20 ч), измеряя толщину каждой из задних лапок инженерным микрометром (или по объему вытесненной воды), определяют выраженность отека в мм (или в мл) по разнице между толщиной (объемом) двух задних лапок каждого животного и вычисляют среднегрупповые показатели отека животных опытной и контрольной групп.
|
|
|
Определение реагиновой гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ):
опытным и контрольным крысам внутрибрюшинно вводят 6-8 мл среды 199 и в течение 1-1,5 мин проводят легкий массаж передней стенки живота. Затем по средней линии делают послойный разрез длиной 1,5-2 см и, перевернув животное, собирают перитонеальную жидкость в пробирку, смоченную гепарином, центрифугируют при 1000 об./мин в течение 5 мин. Осажденные тучные клетки ресуспензируют в среде 199 до концентрации 10 
мл.
На предметное стекло, окрашенное 0,03% нейтрал-рот (в абсолютном спирте) наносят 0,05 мл суспензии тучных клеток и добавляют 0,05 мл суспензии микроорганизмов-продуцентов или препарата в концентрации, которая не вызывает дегрануляции тучных клеток интактных крыс. Смесь покрывают покровным стеклом, края которого смазывают вазелином и помещают в термостат при 37°С на 10-15 мин. Затем под микроскопом подсчитывают число дегранулированных клеток на 50 тучных клеток.
|
|
|
Для оценки антигенности микроорганизмов применяют определение иммунных антител в реакциях агглютинации и фагоцитоза изучаемого микроорганизма нейтрофилами крови.
Реакция агглютинации:
готовят сыворотки крови опытных и контрольных животных. Реакцию выполняют в пробирках 10х75 мм по 10 штук в ряду для каждой сыворотки; в первую пробирку каждого ряда наливают 0,95 мл, в остальные - по 0,5 мл физиологического раствора. Затем в первую пробирку добавляют 0,05 мл испытуемой сыворотки крови, перемешивают и переносят 0,5 мл во вторую и т.д. до последней пробирки, из которой лишние 0,5 мл выливают. После получения двукратного разведения сывороток (от 1:20 до 1:10250) в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл взвеси живой культуры микроорганизма-продуцента, содержащей 10 
кл./мл; перемешивают содержимое встряхиванием и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об./мин. Реакцию считают положительной, если в пробирке появляется осадок, дающий крупные хлопья при осторожном постукивании по нижней части пробирки. За титр агглютининов принимают наибольшее разведение сыворотки, вызывающее агглютинацию микроорганизмов. Вычисляют среднегеометрическое, используя log 
основания титра.
|
|
|
Реакция фагоцитоза:
из живой культуры микроорганизма-продуцента готовят суспензию на физиологическом растворе, содержащую 10 клеток/мл; к 0,1 мл данной суспензии добавляют 0,1 мл гепаринизированной крови как опытных, так и контрольных животных, перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 мин (реакцию ставят или в полистероловых планшетах, или в обрезанных пробирках), затем приготовляют мазки для подсчета формулы крови. Подсчитывают 200 нейтрофилов крови, вычисляют процент фагоцитирующих нейтрофилов и индекс активности фагоцитоза (общее число фагоцитированных микроорганизмов, разделенное на число фагоцитирующих нейтрофилов).
Для оценки иммуномодулирующего эффекта определяют в крови и лимфоидных органах содержание лимфоцитов, Т- и В-лимфоцитов и ауто-РОК (прекиллеры и предшественники иммунорегулирующих Т-клеток), массовые коэффициенты лимфоидных органов (тимус, селезенка, трахеобронхиальные и брыжечные лимфоузлы). Содержание лимфоцитов и их популяций определяют как в процентах, так и по числу в 1 мкл крови или 1 г органа; исследования проводят одновременно с гематологическим анализом.
Выделение лимфоцитов:
под эфирным наркозом забирают кровь из подъязычной артерии без антикоагулянта (получение сыворотки крови) и с антикоагулянтом - гепарином (для выделения лимфоцитов и аутоэритроцитов). После декапитации выделяют лимфоузлы, тимус и селезенку. Органы взвешивают для последующего пересчета содержания лимфоцитов в 1 г органа, промывают в забуференном физиологическом растворе (pH=7,3), подсушивают фильтровальной бумагой, измельчают ножницами, затем - в фарфоровой ступке и протирают через двойную капроновую сетку. Клетки ресуспензируют в 2 мл забуференного физиологического раствора, подсчитывают их число в 1 мкл в камере Горяева. Лимфоциты выделяют в градиента* плотности верификола или верографина по общепринятым методикам. В реакциях розеткообразования используют взвесь лимфоцитов в концентрациях 2-5х10 кл./мл.
________________
* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
Определение Т-лимфоцитов:
в силиконированной пробирке смешивают 0,1 мл взвеси лимфоцитов и 0,1 мл 0,5-процентной взвеси отмытых эритроцитов барана (при исследовании Т-лимфоцитов крыс, мышей) или эритроцитов кролика (при определении Т-лимфоцитов морских свинок), затем инкубируют при 37°С в течение 15 мин, центрифугируют в течение 1-2 мин при 1000 об./мин, затем 1 ч выдерживают в холодильнике при 4°С, после чего сразу же добавляют для фиксации розеток 0,1 мл 0,6-процентного глютарового альдегида, выдерживают при комнатной температуре 15-20 мин, центрифугируют при том же режиме, из осадка готовят мазок, высушивают, фиксируют метанолом в течение 3 мин, промывают дистиллированной водой, окрашивают по Романовскому-Гимза. Подсчитывают 200 лимфоцитов, вычисляют процент Т-лимфоцитов, образовавших розетки не менее чем с тремя эритроцитами.
Определение В-лимфоцитов:
проводится так же, как и определение Т-лимфоцитов, но вместо эритроцитов в реакцию вводят 0,1 мл 0,1-процентной взвеси зимозан-комплемента (зимозан, проинкубированный в течение 30 мин при 37°С с комплементом морской свинки и отмытый от последнего в физиологическом растворе). Доля лимфоцитов, фиксирующих 3 и более зерен зимозана, отражает процент В-лимфоцитов.
Определение ауто-РОК (по Х.М.Векслеру):
в силиконированной пробирке смешивают 0,1 мл взвеси лимфоцитов и 0,1 мл аутосыворотки, инкубируют при 8°С в холодильнике в течение 30 мин, затем добавляют 0,1 мл 0,5-процентной взвеси аутоэритроцитов и оставляют на 5 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют 5 мин при 1000 об./мин и еще 18 часов инкубируют при 8°С. Далее фиксируют глютаровым альдегидом, готовят мазки, окрашивают их и ведут подсчет так же, как и при определении процента Т-лимфоцитов.
Иммуномодулирующий эффект изучают также на крысах, предварительно иммунизированных эритроцитами барана. При таком подходе выявляется суммарное содержание активированных Т- и В-лимфоцитов. Последний вариант дает возможность одновременного определения в сыворотке крови крыс титра специфических антител к эритроцитам с помощью реакции прямой гемагглютинации. Это позволяет дополнительно оценить отдельно антителообразующую способность В-лимфоцитов, т.е. их функциональную активность.
Для скрипинг-метода возможно использование клеток тимуса и селезенки, минуя градиентное центрифугирование с фиккол-верографином. Лимфоидные клетки используют в концентрации 2-5х10 в 1 мл ЭБР. При этом достаточно оценить динамику показателей относительного содержания иммунокомпетентных клеток двух классов Т- и В-систем иммунитета.
Оценку выраженности иммунотоксического эффекта определяют, вычисляя достоверность различия, среднегрупповых показателей опытных и контрольных животных, а также учитывая число животных с проявлением иммунотоксического действия:
сенсибилизирующего - появление ГЗТ, ГНТ, положительных тестов на химические аллергены;
антигенного - появление иммунных антител, существенное усиление фагоцитоза микроорганизма-продуцента;
неспецифического иммуномодулирующего - выход за пределы средненормальных показателей содержания Т-, В-лимфоцитов и ауторозеткообразующих клеток. За пороговую концентрацию принимают ту, при действии которой не более, чем у 1/3 опытных животных были обнаружены признаки одного или всех типов иммунотоксического действия, а среднегрупповые показатели существенно не отличались от таковых у контрольных животных. За действующую концентрацию принимают ту, при воздействии которой признаки иммунотоксического эффекта были выявлены более чем у половины животных, а среднегрупповые показатели статистически достоверно отличались от контрольных.
Дата добавления: 2021-04-05; просмотров: 77; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!