Доставка, основанная на клетках
Вторая стратегия предполагает использование живых клеток для доставки терапевтических трансгенов в организм. В этом методе клетками доставки часто являются стволовые клетки, лимфоциты, фибробласты, они удаляются из организма, и терапевтический трансген, вводимый в них через те же транспортные средства, используемые в ранее описанном прямом методе передачи. В лаборатории генетически модифицированные клетки испытываются и затем растут и размножаться и, наконец, вводятся обратно в организм пациента (рис.7.2)
Генная терапия с использованием генетически модифицированных клеток предлагает несколько уникальных преимуществ по сравнению с прямым переносом гена в организм и надклеточной терапией, которая включает введение клеток, генетически немодифицированных. Во-первых, добавление терапевтического трансгена в клетки доставки происходит вне пациента, что позволяет ученым иметь высокую степень контроля, поскольку они могут выбирать и работать только с теми клетками, которые содержат трансген и производят терапевтический агент в достаточном количестве. Во-вторых, исследователи могут методом генной инженерии, или «программы», регулировать в клетках уровень и темпы производства терапевтического агента. Клетки могут быть запрограммированы, чтобы устойчиво в большом количестве производить терапевтический продукт. В некоторых случаях желательно программировать клетки, чтобы сделать большее количество терапевтического агента, и вероятность того, что достаточное количество, которое секретируется, достигнет пораженной ткани у пациента будет более высока. В других случаях желательно программировать клетки производить терапевтический агент в регулируемой форме. В этом случае терапевтический трансген будет активен только в ответ на определенные сигналы , такие как препараты для пациента , чтобы включить терапевтический трансген и выключить.
|
|
|
Исследователи могут использовать один из нескольких подходов для коррекции дефектных генов:
-нормальный ген может быть вставлен в неспецифическое месте в геноме и заменить нефункциональный ген. Этот подход является наиболее распространенным.
-аномальный ген может быть выгружен для нормального гена через гомологичные рекомбинации.
-аномальный ген может быть исправлен с помощью селективной обратной мутации, которая возвращает ген в нормальное функционирование.
-регулирование (включение или выключение) определенного гена могут быть изменены .
ВЕКТОРЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
В большинстве исследований генной терапии, "нормальный" ген вставляется в геном и заменяет "ненормальный", болезнетворный ген. Молекула-носитель называется вектор и должна быть использован для доставки терапевтического гена в клетки-мишени пациента. В настоящее время наиболее общим вектором является вирус, который был генетически изменен, чтобы нести нормальную ДНК человека . Вирусы развили способ инкапсуляции и доставки генов с клетками человека в патогенной форме. Ученые попытались воспользоваться этой возможностью и манипулировать геном вируса, чтобы удалить болезнетворные гены и вставить терапевтические. Клетки-мишени, такие как в печени или легких, заражаются вирусным вектором. Вектор затем выгружает свой генетический материал, содержащий терапевтический ген человека, в клетки-мишени.Генерирование функционального белкового продукта из терапевтического гена восстанавливает клетки-мишени в нормальное состояние (рис. 7.3) .
|
|
|
 |
Некоторые из различных типов вирусов используются в качестве векторов в генной терапии (рис. 7.4) :
-Ретровирусы:класс вирусов , которые могут создать двунитевые копии ДНК их РНК геномов. Эти копии своего генома могут быть интегрированы в хромосомы клеток-хозяев. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является ретровирусом .
|
|
|
-Аденовирусы:класс вирусов с двухцепочечной ДНК геномов, которые вызывают дыхательные, пищеварительные и глазные инфекций у людей. Вирус, который вызывает простуду, является аденовирусом .
-Аденоассоциированные вирусы: класс мелких, двухцепочечных ДНК вирусов , которые могут вставить свой генетический материал в определенное место хромосомы .
-Вирусы простого герпеса: класс двухцепочечных ДНК вирусов , которые заражают определенный тип клеток, нейроны. Вирус простого герпеса 1 типа является общим человеческим патогеном , вызывающим герпес .
Невирусные методы
Невирусные методы представляют определенные преимущества перед вирусными методами, с простым крупномасштабным производством и низкой иммуногенностью хозяина. Ранее низкие уровни трансфекции и экспрессии гена , ставившие невирусные методы в невыгодное положение , однако , последние достижения в векторной технологии дали молекулы и методы с эффективной трансфекцией , аналогичной вирусам.
• Обнаженная ДНК: это самый простой метод невирусной трансфекции. Клинические испытания , проведенные при внутримышечной инъекции обнаженной ДНК плазмиды пршли с некоторым успехом , однако выраженность была очень низкой по сравнению с другими методами трансфекции. В дополнение к испытаниями с плазмидами , были испытания с невооруженным ПЦР-продукта , который имел аналогичный или больший успех . Этот успех , однако, не сравнить другими методами, что приводит к исследованию более эффективных методов доставки обнаженной ДНК , таких как электропорация и использование пистолета , который стреляет частицами покрытых золотом ДНК в клетку с помощью высокого давление газа .
|
|
|
• Олигонуклеотиды : Использование синтетических олигонуклеотидов в генной терапии заключается в инактивации генов, участвующих в процессе болезни . Есть несколько методов, с помощью которых оно осуществляется . Одна из стратегий использует антигенспецифический к гену-мишени , чтобы сорвать транскрипцию дефектного гена . Другой использует небольшие молекулы РНК , называемые sirРНК , чтобы сигнализировать клетки расщеплять определенные уникальные последовательности в мРНК транскрипта дефектного гена , нарушая перевод неисправного мРНК и, следовательно, экспрессии гена . Дальнейшая стратегия использует двунитевые олигодезоксинуклеотиды в качестве приманки для транскрипционных факторов , которые необходимы для активации транскрипции гена-мишени . Транскрипционные факторы связываются с приманкой вместо промотора дефектного гена , который уменьшает транскрипцию гена-мишени , снижая экспрессию . Кроме того, одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК были использованы , чтобы направить одно изменение базы с мутантным геном . Олигонуклеотид предназначен для отжига с комплементарности к гену-мишени , за исключением центральной базы , целевой базы, который служит в качестве шаблона базы для ремонта. Этот метод называют олигонуклеотид- опосредованной генной репарацией, направленной генной репарацией , или целевым нуклеотидным изменением.
• Липоплекс и полиплекс: для улучшения поставки нового ДНК в клетку , ДНК должны быть защищены от повреждений и его поступление в клетку должны быть облегчено .
С этой целью были созданы новые молекулы , липоплекс и полиплекс, которые обладают способностью защищать ДНК от нежелательной деградации в процессе трансфекции . Плазмидная ДНК может быть покрыта липидами организованной структуры , такими как мицеллы или липосомы . Когда организованная структура образует комплекс с ДНК его называют липоплекс . Есть три типа липиды, анионные ( отрицательно заряженные ) , нейтральный или катионный ( положительно заряженные ) . Первоначально, анионные и нейтральные липиды были использованы для построения из липоплексов синтетических векторов. Тем не менее, несмотря на токсичность, связанную с ними , они совместимы с жидкостями организма и существует возможность адаптации , чтобы они были тканеспецифичны ; они сложны и отнимает много времени , чтобы произвести таким образом, внимание было обращено в катионные версии. Наиболее распространенное использование липоплекса был в переносе генов в раковые клетки , где поставляемые гены активировали гены контроля супрессоров в клетке и снижали активность онкогенов . Недавние исследования показали, что липоплекс может быть полезным в трансфекции эпителиальных клеток дыхательных путей , так что они могут быть использованы для лечения генетических заболеваний дыхательных путей , таких как муковисцидоз. Комплексы полимеров с ДНК называются полиплекс. Большинство полиплекс состоят из катионных полимеров и их производство регулируется ионными взаимодействиями . Разницей между методами действия полиплекс и липоплекс является то, что полиплекс не может освободить свою нагрузку ДНК в цитоплазму , так и с этой целью со- трансфекции эндосомолитических агентов ( лизировать эндосомы , что делается во время эндоцитоза , процесс, при котором полиплекс проникает в клетку ), такие как инактивированная аденовирусов должно произойти . Тем не менее, это не всегда так, полимеры, такие как полиэтиленимин имеют свой собственный способ разрушения эндосом , как это делает хитозан и три - хитозан .
Терапевтический ДНК также может попасть внутрь клетки-мишени путем химического связывания ДНК с молекулой, которая будет связываться с особыми рецепторами клеток . После связывания с этими рецепторами , терапевтические конструкции ДНК проходит внутрь клетки-мишени. Эта система доставки менее эффективна, чем другие варианты.
ОГРАНИЧЕНИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
• короткометражный характер генной терапии: Перед генной терапией стоит задача постоянного лечения в любых условиях , терапевтический ДНК, введенный в клетки-мишени, должны оставаться функциональными и клетки , содержащие терапевтический ДНК должны быть долгоживущими и стабильными. Проблемы с интеграцией терапевтической ДНК в геном и быстро делящиеся характер многих клеток не позволяют генной терапии достичь каких-либо долгосрочных выгод . Пациенты должны будут пройти несколько раундов генной терапии.
• Иммунный ответ : В любое время иммунная система может атаковать чужеродный материал, введенный в организм человека. Риск стимуляции иммунной системы таким образом снижает эффективность генной терапии. Кроме того, усиливается реакция иммунной системы на захватчиков , которых она встречала и раньше, это осложняет повторные генные терапии у пациентов .
• Проблемы с вирусными векторами : Вирусы, как методы выбора в большинстве исследований генной терапии , представляют целый ряд потенциальных проблем для пациента - токсичность, иммунные и воспалительные реакции, а также контроля гена и ориентация в вопросе. Кроме того, всегда существует опасность того, что вирусный вектор , как только окажется внутри пациента, может восстановить свою способность вызывать заболевание.
• мультигенные расстройства: Условия или нарушения , которые возникают в результате мутаций в одном гене являются лучшими кандидатами для генной терапии . К сожалению, некоторые из наиболее часто встречающихся заболеваний, таких как болезни сердца, высокое кровяное давление, болезнь Альцгеймера , артрит и диабет , обусловлены совокупным воздействием изменений во многих генах .Мультигенные или многофакторные заболевания, такие как эти, будут представлять трудности для эффективного лечения с помощью генной терапии .
Дата добавления: 2020-12-12; просмотров: 77; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!