Гибридомы. Значение гибридом для производства современных диагностических препаратов.
Лимфоидные гибридомы — это бессмертные клеточные клоны, продуцирующие антитела одной специфичности (моноклональные). Гибридомы получают посредством слияния раковой клетки лимфоидного ряда и «нормального» зрелого лимфоцита. От раковой клетки гибридома наследует способность к неограниченной пролиферации, а от «нормального» лимфоцита — способность синтезировать антитела. Гибридомы синтезируют на основе банка клеток-носителей (линий раковых клеток), клон лимфоцитов, в принципе, можно получить практически на любой интересующий антиген. На данный момент в мире существует более 50 тыс. гибридом. Получены гибридомы на основе клеток мышей, крыс, золотистого и китайского хомячков, клеток человека и т.д. Первоначально были получены гибридомы на основе клеток мыши линии balb/c, технология получения которых была разработана ранее. В настоящее время банк гибридом пополняется посредством получения гибридом на интересующие исследователей антигены. Гибридомная технология на данном этапе является единственной технологией, позволяющей получать моноклональные антитела в необходимом количестве, и занимает ведущее место в коммерческом обороте продуктов биотехнологии.
Гибридомная технология, в ее классическом варианте, выполняется в несколько этапов. В качестве предпосылок, необходимо иметь линию раковых клеток-носителей, дефектных по одному из ферментов (тимидинкиназе (ТК) или гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ)), что само по себе определяет выбор способа селекции образующихся гибридом; разработанную процедуру слияния клеток; антиген, антитела на который необходимо получить исследователю, методики определения продуцируемых гибридомой антител с целью клонирования необходимой линии. При наличии всего вышеперечисленного процедура получения лимфоидных гибридом выглядит следующим образом (рис 1):
|
|
|
· иммунизация животных выбранным антигеном и выделение «нормальных» лимфоцитов иммунизируемого животного после определения максимального титра интересующих исследователя антител;
· культивирование раковых клеток-носителей;
· проведение слияния клеток-носителей с «нормальными» лимфоцитами (в классическом варианте с помощью полиэтиленгликоля);
· проведение процедуры селекции образующихся гибридом с помощью среды ГАТ. Клетки, имеющие дефект по одному из перечисленных ферментов (ТК или ГГФРТ), не способны расти в ГАТ среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Аминоптерин блокирует синтез dTMP посредством ингибирования дигидрофолят-редуктазы.
· проведение процедуры культивирования полученных лимфоидных гибридом и выделение клона гибридом, продуцирующего необходимые антитела (выделение клона, продуцирующего нужные исследователю антитела необходимо, т. к. только в этом случае будет происходить наращивание концентрации гибридом данного типа);
|
|
|
· проведение изучения полученных гибридом;
· наращивание концентрации моноклональных антител in vivo (с помощью асцитных жидкостей) или in vitro.
Получение и применение моноклональных антител.
Как образуются антитела? Иммунный ответ - сложный процесс межклеточных взаимодействий различных типов лимфоидных клеток с участием специальных гормонов, в результате чего В-лимфоциты начинают активно синтезировать и выделять в кровь специфические антитела против данного антигена. На поверхности В-лимфоцитов существуют рецепторы, аналогичные антителам, взаимодействие которых с антигеном в сложном межклеточном комплексе служит стимулом для начала биосинтеза антител.
Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Антитела выделяют из сыворотки в виде g-глобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Полученные антитела содержат много примесных белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии.
|
|
|
Стандартные препараты получить довольно сложно, так как состав их зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации, других малоконтролируемых факторов. В то же время, для современного биохимического анализа очень важна специфичность, то есть способность выделить данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотки крови, сок растений, ферментная среда. Такое возможно при использовании иммунохимического метода, использующего антитела, взаимодействующие узко специфично по принципу "антиген - антитело". Для проведения такого анализа необходимы абсолютно идентичные антитела, синтез которых обычными способами не приемлим.
методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro.
Животное иммунизируют, в ответ на введение антигена в организме мыши активизируются продуцирующие антитела В-лимфоциты. Эти клетки могут жить только в организме хозяина, при переводе на искусственную питательную среду они гибнут. Если слить иммунную клетку с опухолевой, образуются гибридные клетки, способные неограниченно долго жить в искусственных средах. Одновременно они сохраняют способность синтезировать антитела.
|
|
|
Гибридомы, синтезирующие определенные виды антител, отбирают на селективных ростовых средах. Затем их помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных клеток (клон). Такие клоны могут синтезировать антитела, получившие название моноклональных (МКА). МКА - антитела, однородные по структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах.
Др. метод: основан на инъекции полученной гибридомы в брюшную полость мышки. Там гибридома реплицируется и вызывает образование асцитной опухоли (скопления клеток, плавающих в жидкости, заполняющей брюшную полость). Асцитная жидкость, выделенная из этой мыши, представляет суспензию, содержащую антитела. Клетки и белки, не относящиеся к МКА, удаляются. Оставшийся материал, представленный преимущественно антителами, используют. Этот метод позволяет получать высококонцентрированные препараты антител. Но массовое производство требует одновременного использования нескольких тысяч мышей. Кроме того, получаемый материал требует доочистки. Это дорого и трудоемко, поэтому в настоящее время предпочтение отдается первому способу, с использованием культуры клеток.
Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 1147; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!