Методы культивирования вирусов
1. Организм лабораторных животных
Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримышечно, интраназально, интрацеребрально и др.) в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях весьма ограничено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека, контаминации животных посторонними микробами, а также по экономическим и этическим соображениям.
2. Куриные эмбрионы
Куриные эмбрионы (5-12 дневные) заражают путем введения исследуемого материала в различные полости (аллантоисная, амниотическая, желточный мешок) и ткани зародыша. Таким образом, можно культивировать вирусы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Достоинствами модели являются возможность накопления вирусов в больших количествах, отсутствие скрытых вирусных инфекций, доступность для любой лаборатории.
3. Клеточные культуры
Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавт., получившими за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и других биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых тканей, обладающих по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более активной способностью к росту и размножению.
|
|
|
Типы тканевых культур
1. Первичные (трипсинизированные) культуры - фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных. Их получают из клеток различных тканей путем размельчения и трипсинизации. Используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.
2. Линии диплоидных клеток (полуперевиваемые) пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило, не более 40-50 пассажей (теряют исходные свойства). Их обычно получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, не претерпевают злокачественной трансформации, но имеют ограниченную продолжительность жизни. Так, например, пользуется известностью штамм ДКЛЧ (диплоидные клетки лёгких человека), штаммы WJT-38, JMR-90, MRC-5 из лёгких ткани эмбриона человека.
3. Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам. Наиболее удобны в вирусологической работе - линии опухолевых клеток Hela (рак шейки матки), Hep (рак гортани).
|
|
|
Питательные среды, используемые для выращивания культур клеток: среда 199, среда Игла и др.
Методы индикации вирусов
Индикация вирусов – обнаружение факта их репродукции, основана на выявлении различных биологических свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками.
Индикацию вирусов проводят на основе следующих феноменов: ЦПД вирусов, образования внутриклеточных включений, образования бляшек, реакции гемагглютинации, гемадсорбции, «цветной» реакции (табл.37).
Таблица 37. Методы индикации вирусов
| ЦПД (цитопатическое действие) - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов. ЦПД вируса в культуре клеток можно выявить микроскопией в сроки от 3-5 суток после заражения и до 1 месяца. |
| ||||
| Включения - скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы - внутриядерные включения. | 
| ||||
| Бляшки, или “негативные” колонии - ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной бляшки. “Негативные” колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации (качественно-количественный). | 
| ||||
| РГА (реакция гемагглютинации ) основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов – гемагглютининов. Проводится в течение 2-х часов. | 
| ||||
| Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты за счет включения в их оболочку гемагглютинина вируса. | 
| ||||
| “Цветная” реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и соответственно цвета индикатора смалинового на желтый. При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный малиновый цвет.
| |||||
III. План практической работы
1. Изучить и записать методику заражения клеточной культуры вирусом полиомиелита.
Материал для исследования:смывы из зева (первые дни болезни), фекалии.
Вирусологическое исследование. Выделение энтеровирусов из исследуемого материала осуществляют путем заражения клеточных культур. Для уничтожения сопутствующей бактериальной микрофлоры нестерильный материал (испражнения, глоточные смывы) предварительно обрабатывают антибиотиками (смесь пенициллина со стрептомицином, содержащая по 1000 ЕД/мл каждого антибиотика в среде 199) в течение суток при 4ºC, после чего производят контрольный посев на стерильность. При сохранении бактериальной флоры материал повторно обрабатывают теми же антибиотиками. Затем одновременно заражают по 2-3 пробирки с первичной (эмбриональные фибробласты человека или клетки почек обезьян) и перевиваемой культурой клеток (HeLa, амниона человека и др.), поскольку одни серотипы энтеровирусов лучше репродуцируются в первичных, другие – в перевиваемых клетках. Индикацию вирусов проводят по ЦПД на 2-3 день инкубации при 35 ºC.
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 1053; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!