Методы генетической идентификации (ПЦР, МГ)
Одним из важных научных достижений последних 20 лет стала разработка и внедрение в практику комплекса чувствительных, специфичных, ускоренных и экспрессных молекулярно-биологических методов, обеспечивающих раннее выявление возбудителя и его точную идентификацию. Эти методы позволяют обнаруживать отдельные гены или последовательности нуклеиновых кислот, специфичные для каждого возбудителя заболевания, объединяют понятием ДНК-диагностика или «генодиагностика».
Сегодня использование молекулярно-биологических методов в лабораторной диагностике регламентировано Приказом Минздрава №64 от 21.02.2000 «Номенклатура клинических лабораторных исследований». Молекулярные методы все шире используются в различных отраслях медицины. Продолжают быстро появляться новые методики молекулярной диагностики. Разработаны сотни методов гибридизации и десятки способов детекции полученных результатов. Одним из последних достижений в области гибридизации нуклеиновых кислот стала разработка новых диагностических систем – биологических чипов.
Основой ДНК технологий является гибридизация – специфическое взаимодействие генетически родственных (комплементарных) цепей нуклеиновых кислот. В основе гибридизации лежит способность ДНК к саморепликации. Известно, что спираль ДНК построена из двух дискретных нитей, удерживаемых вместе водородными связями между комплементарными основаниями (аденин-тимин, гуанин-цитозин). Водородные связи непрочные и двухцепочечная ДНК разделяется на две нити при нагревании до 95-100ºС. При понижении температуры происходит гибридизация ДНК с образованием двухцепочечной структуры. Для диагностической гибридизации используют не всю ДНК, а лишь ее участок, специфический фрагмент, который обнаруживают с помощью искусственно созданного зонда, обладающего комплементарностью. Для детекции произошедшего взаимодействия специфического фрагмента ДНК возбудителя и зонда, последний метится легко разпознаваемой меткой. В первых разработках использовали радиоактивные метки, затем их вытеснили ферментные, которые в последнее время уступают место флюоресцентным.
|
|
|
Гибридизация возможна не только между ДНК-ДНК, но и ДНК-РНК, РНК-РНК. В настоящее время для гибридизации часто используется 16S рибосомальная РНК (16S рРНК), которая отличается у разных видов микроорганизмов и представлена тысячами идентичных копий в каждой клетке (в отличие от генов, которые чаще имеют единственную копию). Это значительно повышает чувствительность тестов, основанных на выявлении рРНК. Специфичность гибридизации оценивается как высокая 99,2 – 99,5%. Для проведения гибридизации не требуется выделение чистой культуры возбудителя, а процесс идентификации занимает 6-48 часов.
|
|
|
Существуют различные форматы проведения молекулярной гибридизации: in situ, в жидкой среде (растворы), на плотных поверхностях (кремний, стекло, мембранные фильтры, в геле и др.). Гибридизация проводится в несколько этапов: 1) обработка исследуемого материала с целью разрушения исследуемого микроорганизма, высвобождение ДНК и ее последующая денатурация; 2) внесение диагностического меченого зонда; 3) детекция и интерпретация полученных результатов. Методы детекции определяются типом использованных меток: радиометрия (излучение), иммунофлюоресценция, иммуноферментный анализ. В новейших ДНК-технологиях используют для регистрации результатов используют биосенсоры, которые улавливают изменения светопреломления, происходящие в процессе гибридизации.
В микробиологии методы генетического анализа используются для идентификации микроорганизмов: секвенирование ДНК для определения нуклеотидной последовательности генов или фрагментов ДНК для выявления эволюционных связей на уровне царства, отдела, класса, семейства и рода; гибридизация ДНК с рибосомной РНК выявляет родство на уровне семейства и рода; молекулярная гибридизация ДНК-ДНК (метод выявления гомологии ДНК) для определения родства на уровне рода и вида; рестрикционных анализ ДНК («фингерпринтинг»), позволяющий осуществить внутривидовое типирование.
|
|
|
Сегодня широкое практическое применение ДНК-технологий ограничивает нерасшифрованность геномов большинства бактерий. В связи с этим в настоящее время выполняется международный проект Геном микробиомы человека (Human microbiome), целью которого является секвенирование геномов всех резидентных бактерий организма человека.
По чувствительности метод ДНК-гибридизации равен культуральному. Для повышения чувствительности гибридизационных методов и выявления минимальных количеств искомой ДНК в настоящее время широко используют приемы амплификации - предварительного умножения (копирования) и накопления количества молекул искомой ДНК, что впоследствии упрощает детекцию и идентификацию.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 году. ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического фрагмента ДНК катализируемое ферментом ДНК- полимеразой. В этой реакции искусственно, in vitro, воспроизводят созданный природой феномен. Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий: 1) денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК); 2) образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК); 3) синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей). Целенаправленный поиск специфических фрагментов является целью генодиагностики с целью выявления возбудителей инфекционных заболеваний.
|
|
|
Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus, оптимум работы которой находится в области 70-72оС, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим и использовать его для работы in vitro. Создание программируемых термостатов (амплификаторов), которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза. Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границе специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.
Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три последовательных этапа: 1) выделение ДНК (РНК) из клинического образца; 2) амплификация специфических фрагментов ДНК; 3) детекция продуктов амплификации.
На этапе выделения клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободного от ингибиторов и готового для дальнейшей амплификации. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном определяется характером обрабатываемого клинического материала.
На этапе амплификации происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для последующей детекции. В большинстве методик определения специфических фрагментов генома используется вариант направленной ПЦР, т.е. поиск специфического фрагмента парой специфических праймеров.
Каждый цикл амплификации включает три этапа, протекающие в различных температурных режимах:
1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95о в течение 30-40 сек.
2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65оС. Время отжига 20-60 сек.
3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72оС. Время протекания синтеза 20-40 сек
Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n-число циклов амлификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации
На этапе детекции проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образующий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле.
Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:
1. ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);
2. Праймеры (синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплиментарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.
3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК).
4. Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК).
5. Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента).
Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов, сначала получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции (RT), катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).
ПЦР имеет ряд преимуществ для диагностики инфекционных заболеваний:
1. Прямое определение наличия возбудителей.Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
2. Высокая специфичность.Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.
3. Высокая чувствительность. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток).
4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.
5. Высокая скорость получения результата анализа. Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 часа.
6. Возможность качественного и количественного выявления в одной пробе сразу нескольких возбудителей, что особенно актуально при смешанных формах инфекциях.
7. Возможность видовой и даже внутривидовой дифференциации. При наличии качественных праймеров ПЦР позволяет проводить внутривидовую дифференциацию возбудителей (определять вид и даже штамм микроорганизма). Это необходимо, когда известно несколько видов возбудителя, различных по патогенности.
8. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.
Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.)
Однако, как и любой другой метод лабораторной диагностики, ПЦР имеет и ряд недостатков. ПЦР свойственна определенная сложность и многоэтапность, которая требует специально подготовленного персонала. При постановке ПЦР существует риск получения как ложноположительных результатов вследствие попадания в пробирку положительной ДНК, что может быть связано с ДНК положительного контроля, ДНК из положительного клинического образца, ампликонами предыдущей амплификации, контаминации в ходе проведения анализа. Появление ложноотрицательных результатов связано с тем, что клинический материал это сложная система, содержащая соединения, ингибирующие активность фермента, катализирующего амплификацию. Кроме того, существует сложность при дифференциации живого и погибшего возбудителя.
Существуют различные форматы проведения ПЦР: гнездная (nested PCR), многомишеневая, с использованием рестрикционного анализа. Однако, в настоящее время, для практических целей наиболее часто используется ПЦР в реальном времени (Real time PCR). Данный подход позволяет практически исключить проблему контаминации, повысить специфичность, а также провести не только качественный, но и количественный анализ. Использование флуоресцентно-меченых зондов, позволяет оценить накопление специфического продукта амплификации по увеличению уровня флуоресцентного сигнала в режиме реального времени процесса ПЦР. В этом случае, возможно провести количественную оценку накопления специфического продукта после каждого цикла амплификации и построить по этим данным кинетическую кривую реакции ПЦР. При данном методе детекции по мере накопления специфических продуктов амплификации происходит синхронное увеличение флуоресцентного сигнала, который детектируется в соответствующем термоциклере или флуориметре. Таким образом, в Real time ПЦР одновременно происходит процесс амплификации и детекции, т.е анализ результатов осуществляется без извлечения ампликонов из пробирок. Это предопределяет менее строгие требования к организации ПЦР лаборатории.
Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике.
Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции.
Наиболее эффективно и экономически обоснованно использование метода в урогинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов, ВИЧ и цитомегаловирусной инфекции; в гематологии - для выявления онковирусов.
Одним из последних достижений в области генодиагностики стала разработка новых диагностических систем – биологических чипов (biochips, microarrays). Биочип технология заключается в гибридизации неизвестной нуклеотидной последовательности с известными ДНК-последовательностями (зондами), иммобилизованными на какой либо твердой поверхности (кремний, стекло, мембранные фильтры, гель, пленка из диоксида и нитрида титана). На носителе могут быть иммобилизованы различные биологические макромолекулы: ДНК, РНК, белки, антитела, полисахариды, различные низкомолекулярные соединения. Иммобилизуемые (известные) молекулы принято называть зондами, а искомые молекулы, которые находятся в исследуемом образце – мишенями. Зонд представляет собой микрокапельку диаметром 100 микрон. В зависимости от носителя, на котором фиксируются зонды, различают матричные (двумерные) и гелевые (трехмерные) чипы. В матричных биомикрочипах зонды иммобилизуют на поверхности мембран или пластинок различных материалов, а в гелевых – в ячейках полиакриламидного геля. Результат детектируется по флюоресценции зонда, предварительно меченного флюорофором, но возможны и другие методы детекции.
Дата добавления: 2019-09-13; просмотров: 421; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!