Логическая модель (кинетическая схема процесса)

Математическая модель процесса

Интегрирование системы управлений

Идентификация модели (дискриминация механизмов)

Проверка адекватности модели

Использование математической модели

Для прогнозирования

И управления процессом.

Необходимость использования ЭВМ в анализе закономерностей микробного роста определяется главным образом возможностями ЭВМ провести численное интегрирование систем дифференциальных уравнений, описывающих развитие во времени микробного процесса. Большая группа кинетических задач может найти кинетическое описание и решение лишь при использовании современной ЭВМ.

Остановимся на двух понятиях, которые сформулированы и решаются в рамках кинетического моделирования - это так называемые прямая и обратная кинетические задачи.

Прямая кинетическая задача - это расчет состава многокомпонентной регулирующей смеси и скоростей реакции на основе заданной кинетической модели с известными или предполагаемыми параметрами. Надежность решения прямой задачи зависит от того, находится ли в нашем распоряжении достоверные знания параметров, полученные из теоретических соображений или из специальных экспериментов.

Обратная кинетическая задача - восстановление на основе экспериментальных данных вида кинетической модели и ее параметров. Универсального решения обратной задачи не существует. Ее решение чаще находят, перебирая серию прямых задач. При этом математической обработке предшествует качественный анализ экспериментальных данных, цель которого – резко сократить число рассматриваемых гипотез.

18. При культивировании фототрофов проводят перемешивание и аэрацию культуральной жидкости путем встряхивания за счет возвратно-поступательного перемещения культиваторов в горизонтальной плоскости при заданных значениях температуры и рН. Культиваторы освещают импульсным источником света с длительностью импульса 0,00001-0,001 с и с длительностью интервала между импульсами 0,01-0,1 с. Используют установку, в которой культуральную жидкость освещают диодами, расположенными под прозрачными днищами сосудов одинаковой геометрической формы и получающими питание от генератора импульсов с регулируемой частотой и длительностью светового импульса Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам культивирования фототрофов, и может быть использован для культивирования фототрофов со снижением энергозатрат и с одновременной биологической регенерацией воздуха в системах жизнеобеспечения (СЖО), в промышленных, бытовых и сельскохозяйственных помещениях и получением биологически активных веществ (БАВ) для пищевой, косметической, химической промышленности и сельского хозяйства.

Культивирование фототрофов с наименьшими затратами на освещение, при постоянно повышающихся ценах на энергоресурсы и ухудшением экологической обстановкой является актуальной задачей мирового уровня. Одним из возможных вариантом решения проблемы является осуществление способа культивирования фототрофов с применением прерывистого (импульсного) освещения.

Известны различные методы культивирования фототрофов. Например, культивирование в открытых водоемах (Глущук Л.П. Аппаратурно-технологическое оформление процесса культивирования цианобактерий Spirulina. Автореферат диссертации, Москва, 2000). Это наиболее простой и дешевый способ, но он применим только в районах с длительным солнечным периодом и незначительными колебаниями температур.

Однако у это метода культивирования существуют недостатки:

- невозможность увеличения эффективности усвоения солнечной энергии, т.к. солнечный свет является главным лимитирующим фактором прироста биомассы;

- в бассейнах, занимающих большую площадь, для того чтобы достигнуть определенной степени перемешивания, толщина слоя суспензии микроорганизмов должна быть не более 150 мм;

- получаемый продукт имеет нестабильный химический состав.

К преимуществам трубчатых реакторов относятся возможность интенсивного освещения, позволяющего добиться высокой плотности биомассы, возможность постоянного контроля за газообменом. В то же время конструктивное решение этих аппаратов затрудняет осуществление процесса со значительным газообменом. Отрицательное влияние этих недостатков на работу аппарата усугубляется с увеличением отношения освещенной поверхности к рабочему объему реактора. Вся световая энергия, поглощенная освещенной поверхностью аппарата и не использованная в процессе фотосинтеза, преобразуется в тепловую.

Известны способы культивирования фототрофов с применением прерывистого освещения с помощью обтюраторов (Светоимпульсная стимуляция растений. Под ред. Шахова А.А. М.: Наука, 1971 - 368 с. Статья А.А.Шахова: Теоретические аспекты преобразования световой энергии в импульсном режиме). Однако применение обтюратора не приводит к снижению затрат электроэнергии.

Наиболее близким к предлагаемой установке, осуществляющим способ культивирования фототрофов является шейкер-инкубатор New Brunswick Innova 42R (http://www.nbsc.com/flles/Innova_42.pdf - рекламный проспект фирмы New Brunswick). В шейкере-инкубаторе New Brunswick Innova 42R прозрачные культиваторы в виде ряда сосудов одинаковой геометрической формы установлены с возможностью встряхивания путем возвратно-поступательного перемещения (в целях аэрации и перемешивания) в горизонтальной плоскости и снабжены источником освещения в виде компактных люминесцентным ламп с возможностью изменения интенсивности освещения, расположенные сверху относительно культиваторов.

Можно назвать следующие недостатки данного способа. В прототипе применяются люминесцентные лампы, в состав которых входит ртуть, что создает проблему утилизации этих ламп. Люминесцентные лампы имеют меньший срок службы и меньший КПД по сравнению со светодиодными источниками освещения. Источник света в данном способе находится на некотором удалении, освещая не только культуру фототрофов, но и среду вокруг нее, что снижает общий КПД всей установки.

К недостаткам следует также отнести невозможность использования в подобной установке импульсного режима освещения, света с длительностью импульса 0,00001-0,001 с и длительностью интервала между импульсами 0,01-0,1 с, соответствующими длительностям световой и темновой фаз фотосинтеза для данного фототрофа, ввиду технологических характеристик люминесцентных ламп.

Задачей изобретения является достижение технического результата - снижение энергетических затрат при культивировании фототрофов. Поставленная задача решается тем, что в способе культивирования фототрофов, заключающемся в перемешивании и аэрации культуральной жидкости встряхиванием колб-культиваторов путем возвратно-поступательного перемещения, поддержании заданных значений температуры, рН и освещении источником света, согласно изобретению освещение осуществляется импульсным источником света с длительностью импульса 0,00001-0,001 с и длительностью интервала между импульсами 0,01-0,1 с, соответствующими длительностям световой и темновой фаз фотосинтеза для данного фототрофа. Установка для осуществления способа включает культиваторы в виде ряда сосудов одинаковой геометрической формы с прозрачными днищами, установленных с возможностью возвратно-поступательного перемещения в горизонтальной плоскости (для аэрации и перемешивания) и снабженных источником освещения, в котором согласно изобретению, источники освещения выполнены в виде набора светоизлучающих диодов, расположенных непосредственно под прозрачными днищами сосудов и соединенных с источником питания в виде генератора импульсов.

Сущность изобретения поясняется фиг.1 и 2, где на фиг.1 изображен прототип, на фиг.2 - заявленная установка. Установка включает в себя культиватор 1, источник импульсного освещения (светоизлучающие диоды) 2, шейкер 3 (для перемешивания и аэрации встряхиванием путем возвратно-поступательного перемещения платформы с культиваторами), источник электропитания - генератор импульсов 4.

1. Способ культивирования фототрофов, заключающийся в перемешивании и аэрации культуральной жидкости путем встряхивания за счет возвратно-поступательного перемещения культиваторов, поддержании заданных значений температуры, рН, освещении источником света, отличающийся тем, что освещение осуществляют импульсным источником света с длительностью импульса 0,00001-0,001 с и длительностью интервала между импульсами 0,01-0,1 с, соответствующими длительностям световой и темновой фаз фотосинтеза для данного фототрофа.

2. Установка для осуществления способа по п.1, включающая культиваторы в виде ряда сосудов одинаковой геометрической формы с прозрачными днищами, в которых перемешивание и аэрация осуществляются встряхиванием путем возвратно-поступательного перемещения в горизонтальной плоскости, и снабженных источником освещения с регулируемой интенсивностью освещения, отличающаяся тем, что источники освещения выполнены в виде набора светоизлучающих диодов, расположенных непосредственно под прозрачными днищами сосудов и соединенных с источником питания в виде генератора импульсов с регулируемой частотой и длительностью светового импульса.

Ассоциация микробов ― это сосуществование двух и более видов микроорганизмов в естественных (природных) и искусственно создаваемых условиях независимо от линии генетических связей и обладающих различными биологическими свойствами. В таком состоянии они могут находиться постоянно (аутофлора) или временно (паразитоценоз) в организме человека и животных. Естественная ассоциация (аутофлора) создается в процессе эволюционного развития между микроорганизмом и макроорганизмом. При этой форме симбиоза они живут на взаимовыгодных условиях, не причиняя вреда друг другу. Паразитическая ассоциация (паразитоценоа) возникает при проникновении в организм патогенного микроба, т. е. возбудителя болезни, и его взаимодействии с представителями аутофлоры. При этом часть аутофлоры приобретает патогенные свойства и вступает в ассоциацию с возбудителем болезни. К мик-робам-ассоциантам могут присоединиться и другие микроорганизмы, которые обычно редко встречаются в здоровом организме (гемолитические эшерихии, синегнойные палочки, палочки Моргана и др.).В условиях паразитической ассоциации происходят количественные изменения видового состава аутофлоры, особенно в динамике болезни. При ассоциации создаются благоприятные условия для передачи генетических признаков путем трансформации, транедукции, конъюгации и эписомными факторами. Симбиоз)—различные формы совместного существования разноименных организмов, составляющих симбиотическую систему. В этих системах один из партнеров или оба, в определенной степени возлагают на другого (или друг на друга) задачу регуляции своих отношений с внешней средой. Основой для возникновения симбиоза могут быть трофические, пространственные и другие типы взаимоотношений. Один из партнеров системы или оба вместе приобретают возможность выигрыша в борьбе за существование. Симбиоз бывает факультативным, когда каждый из организмов при отсутствии партнера может жить самостоятельно, и облигатным, когда один из организмов (или оба) оказывается в такой зависимости от другого, что самостоятельное существование невозможно. По характеру взаимоотношений между партнерами выделяют несколько типов симбиоза: комменсализм, паразитизм и мутуализм. Комменсализм , т. е. сотрапезничество, форма симбиоза, при которой один из партнеров системы (комменсал) возлагает на другого (хозяин) регуляцию своих отношений с внешней средой, но не вступает с ним в тесные отношения. Основой для комменсальных отношений могут быть общее пространство, cyбстрат, кров, пища. Присутствие комменсала для хозяина остается обычно безразличным, т. е. понятие комменсализм сейчас понимается шире, чем сотрапезничество. Аэробный микроорганизм, расходуя кислород, создает условия для развития анаэроба. Многие черты комменсализма можно проследить на процессе нитрификации. Бактерии из рода Nitrosomonas, окисляя аммиак до нитритов, обеспечивают энергетический субстрат для нитробактера. Паразитизм —форма антагонистических взаимоотношений двух различных организмов, при которой один из них (паразит) использует другого (хозяина) в качестве среды обитания (среда 1-го порядка) или источника пищи, возлагая на него регуляцию своих отношений с внешней средой (среда 2-го порядка). Наблюдается различная степень специализации паразитов (приуроченность к различным органам и тканям) и специфичность паразитов (приуроченность определенного вида паразита к определенным видам хозяинаПаразиты принимают участие в регуляции численности популяций хозяев, а иногда определяют направленность микроэволюционных процессов. Паразиты подразделяются на облигатные (обязательные) и факультативные (необязательные). Паразитические микроорганизмы обладают некоторыми факторами патогенности, которые по функциональному значению подразделяются на следующие группы: - инвазивные, т. е. способствующие внедрению в ткани макроорганизма (ворсинки бактерий, способствующие проявлению адгезивных свойств, т. е. прилипанию бактерий к эпителиальным клеткам слизистых оболочек, и ферменты - гиалуронидаза, нейраминидазы, муциназы и др.);

19.Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые культуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3-4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя.

Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.

Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

Культуры органов

Не все виды клеток способны расти в виде монослоя, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживающей ткани.

Куриные эмбрионы

Куриные эмбрионы — практически идеальные модели для культивирования некоторых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проникновению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирования и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбудители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распознавать заболевание). Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость либо в желточный мешок.

Заражение на хорион-аллантоисную мембрану. Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы. Яйца просматривают в проходящем свете, отмечают локализацию воздушного мешка и выбирают область без сосудов. Осторожно удаляют фрагмент скорлупы, освобождают наружную оболочку и отслаивают её осторожным надавливанием. Затем делают отверстие у края воздушного мешка. При отсосе через это отверстие хорион-аллантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. На неё наносят исследуемый материал, свободный от бактерий и простейших (пропущенный через бактериальные фильтры и обработанный бактерицидами).

Заражение в амниотическую полость. Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы, у которых после отслоения хорион-аллантоисной оболочки (см. выше) расширяют отверстие, захватывают пинцетом амниотическую оболочку и выводят через хорион-аллантоисную оболочку. Через неё в амниотическую полость вводят исследуемый материал.

Заражение в аллантоисную по лость. 10-суточные эмбрионы заражают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше).

Заражение в желточный мешок. Используют 3~8-суточные эмбрионы, у которых в этом возрасте желточный мешок занимает почти всю полость яйца. Заражение проводят через отверстие, сделанное в воздушном мешке

Наблюдение и учёт результатов. В качестве вируссодержащего материала можно использовать содержимое желточного мешка, аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими тканями на кусочки. Для выявления характерных поражений на хорион- развивающегося куриного эмбриона.

аллантоисной мембране удаляют скорлупу и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.

Животные модели

При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitroинфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили клеточные культуры. Тем не менее, животные модели активно используют для изучения особенностей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.

Идентификация вирусов

Качественное определение

Наличие и биологическую активность вирусов определяют по эффектам, наблюдаемым на животных моделях (повышение температуры тела, появление характерных клинических признаков, гибель и т.д.), куриных эмбрионах и на клетках (в культурах). Под воздействием конкретных вирусов возможно изменение морфологии, роста, репродукции клеток либо их разрушение. Факт размножения вирусов в чувствительных клетках in vitro определяют по цитопатическим эффектам (в том числе бляшкообразованию, тельцам включений), феномену гемадсорбции, «цветной реакции».

Цитопатические эффекты оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размножение вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клинической картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.

Бляшкообразование. «Бляшками» называют негативные колонии — участки разрушенных клеток, выглядящие как зоны просветления на монослоях клеток, покрытых слоем агара. В некоторых случаях дозу и цитопатогенность вируса выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ).

Тельца включений. Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках характерных образований — скоплений вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварнери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).

Отсутствие цитопатического эффекта. Некоторые вирусы (например, вирус краснухи) не проявляют цитопатического эффекта. Их можно выявлять по интерференции другого вируса, способного вызывать дегенерацию заражённых клеток.

Феномен гемадсорбции. Многие заражённые вирусами клетки приобретают способность сорбировать на своей поверхности различные эритроциты. Феномен гемадсорбции имеет общие механизмы с гемагглютинацией и проявляется на ранних сроках, до проявления цитопатического эффекта, при его отсутствии либо слабой выраженности.

«Цветная реакция». В культуральную среду, используемую для поддержания клеток, вносят индикатор. Рост клеток сопровождается накоплением метаболитов, сдвигом рН среды и изменением окраски индикатора. Заражение культур вирусом резко ингибирует клеточный метаболизм, и среда сохраняет первоначальный цвет.

Экспресс-диагностика. Для быстрой идентификации вирусной инфекции разработаны многочисленные методы экспресс-диагностики, основанные на обнаружении вирусных Аг. Например, для ранней диагностики ВИЧ-инфекции широко используют ИФА, выявляющий поверхностные Ar вируса.

Количественное определение

Количественное определение вирусов проводят двумя путями — изучением инфекционности и количественным определением вирусных Аг. Определение титра инфекционности вирусов в значительной степени зависит от метода количественного исследования; у бактериофагов отношение инфекционность-частица составляет приблизительно 1 (то есть каждая вирусная частица способна вызвать инфекцию), для вирусов животных данное отношение составляет 1:10 (иногда выше из-за вирусингибирующего действия факторов резистентности).

Определение инфекционности вирусов. Наиболее доступная форма количественного определения — подсчёт числа вирусных «бляшек». Прямые тесты на инфекционность применяют для установления инфекционной дозы (ID) или летальной дозы (LD) изучаемого вируса (обычно выражают в lg ). ID₅₀ — разведение, инфицирующее 50% клеток; LD₅₀ — разведение, убивающее 50% поражённых клеток или животных.

Выявление вирусных Аг и вирусных частиц. Наиболее распространённый метод — реакция количественной гемагглютинации. Метод основан на способности вирусов сорбироваться на поверхности эритроцитов животных и человека. Количественную электронную микроскопию применяют для подсчёта общего числа вирусных (но не инфекционных) частиц в исследуемом обьекте (например, культуральной жидкости).

Морфология вирусов

Изучение морфологии вирусов возможно лишь при помощи электронной микроскопии, однако чаще всего этот метод недоступен из-за отсутствия столь дорогого и сложного прибора. Более того, многие возбудители морфологически сходны, что снижает ценность этого метода. Наиболее распространён метод микроскопии содержимого везикул и тканевых экстрактов, обработанных красителями (негативное контрастирование), с последующим подсчётом ДНК- или РHK-содержащих вирусов. Электронная микроскопия позволяет быстро обнаружить орто- и парамиксовирусы в отделяемом дыхательных путей, герпесвирусы в жидкости везикул и ротавирусы в фекалиях.

Серологические методы идентификации

При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.

РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.

Торможение гемагглютинации. РТГА применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым AT.

Прямая иммунофлюоресценция. Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклональных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать не связавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).

Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.

Выявление противовирусных AT в сыворотке

Более простой и доступный подход — выявление противовирусных AT в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2-3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период реконвалесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.

Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать AT, образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую — в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретрос пективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.

РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные AT в сыворотке больного.

РСК — основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.

РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.

Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный Аг сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации не связавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к lg человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наибольшее распространение нашёл метод иммуноблотинга.

Выявление вирусных Аг

ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления Аг некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления Аг на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую Аг; после инкубирования несвязанный Аг декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

Гибридизация ДНК — высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине I комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

Этот метод более универсален. Количество вируса (титр вируса) при этом измеряется в эффективной 50% дозе – ЭД50.

1 ЭД50 = доза вируса, способная вызывать инфекционный эффект у 50% зараженных тест-объектов.

Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект - лабораторные животные (обычно белые мыши), куриные эмбрионы или культура клеток. Инфекционный эффект или действие вируса на разных тест-системах может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. У лабораторных животных и куриных эмбрионов действие вируса оценивается в летальной и инфекционной дозах:

1 ЛД50 - доза вируса, убивающая 50% лабораторных животных;

I ЭЛД50 - доза вируса, убивающая 50% куриных эмбрионов;

1 ИД50 - доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50% зараженных лабораторных животных;

1 ЭИД50 - доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50% зараженных куриных эмбрионов.

В культуре клеток действие вируса оценивается по цитопатическому эффекту или действию (ЦПД):

1 ЦПД50 - доза вируса, вызывающая цитопатический эффект в 50% пробирок с зараженной культурой клеток.

Количество ЭД50 (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, будет выражением титра вируса в этом материале. Так, запись Т = 103.48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждом 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103.48 доз, каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50% пробирок с культурой клеток.

Метод титрования вирусов по 50% инфекционному действию пригоден для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую тест-систему. Недостатком является трудоемкость, длительность и необходимость статистического расчета.

Методика определения титра вируса в единицах 50% инфекционного действия (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50) заключается в том, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала. Это и будет титр вируса. Для этого:

1) из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. Количество разведений необходимо делать больше (т.е. столько, чтобы последнее наиболее высокое уже не давало инфекционного эффекта совсем). Для 10 последовательных разведений в каждую из 10 стерильных пробирок наливают по 9 мл стерильного физиологического раствора, а затем в первую вносят ровно 1 мл исследуемой суспензии. Перемешивают содержимое первой пробирки, набирают 1 мл смеси и вносят во вторую пробирку, перемешивают содержимое и 1 мл из второй пробирки - в третью, и т. д,

2) одинаковыми объемами каждого разведения вируссодержащего материала заражают чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов. В каждой их группе требуется не менее 4-6 тест-объектов (для статистической достоверности);

3) по истечении времени учитывают результат действия вируса на зараженные объекты (гибель, заболевание, патологоанатомические изменения или цитопатический эффект). Гибель лабораторных животных, КЭ впервые 48 часов считают неспецифической. Учет заканчивают через 2 -3 суток после прекращения падежа;

4) определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Действие вируса определяют в ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50 и ЦПД50. Считают, что доза в этом разведении соответствует 1 ЭД50. Дозу вируса подсчитывают различными методами (по Риду и Менчу, Керберу).

Для проведения титрования из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных десятикратных разведений от 1:10, т.е. 10^-1 до 1:10.000.000, т. е. 10^-7, и более (10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5 и т.д.). Количество разведений зависит от предполагаемого титра вируса, их нужно готовить столько, чтобы последнее (наиболее высокое) разведение уже не давало бы инфекционного эффекта. Инфекционное действие вируса (величина инфекционного эффекта) с каждым разведением убывает пропорционально логарифму разведения (или дозы). То есть при разведении 1:100 (10^-2) инфекционное действие уменьшается в два раза, если 1:1000 (10^-3) в три раза и т. д.

Каждым разведением исследуемого вируссодержащего материала в определенном одинаковом объеме заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (лабораторных животных, куриные эмбрионы, культуры тканей). При этом учитывают тропизм и дозы вируса, общепринятые для данного способа введения материала. В каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, т. к. при меньшем количестве статистическая обработка материала будет иметь слишком большую погрешность.

Однако, при определении титра вируса очень трудно подобрать такие разведения, чтобы одно из них в точности вызывало бы гибель 50% зараженных животных. Часто при титровании количество живых и павших животных бывает неравным. В этом случае для более точного определения титра широко используют в вирусологии метод, предложенный Ридом и Менчем. Они рекомендуют при титровании брать в опыт большое количество групп по 4-6 чувствительных моделей в каждой группе. Отклонение от истинной величины ЛД50, обусловленное применением малого количества подопытных животных в группе, исправляется тем, что при исчислении процента летальности оперируют данными кумулятивной летальности (кумуляция - накопление).

Метод Рида и Менча основан на логической предпосылке о том, что животные (и другие модели), погибшие при заражении каким-либо разведением вируса, например 10^-5, погибнут и при заражении более низким разведением (10^-4, 10^-3) вируса. Если же животное не пало при данном разведении, то останется живым и при заражении более высоким разведением (10^-6, 10^-7). На этом основании полученные результаты подвергают интерполяции и выражают их в виде кумулятивных данных, на основании которых рассчитывают % летальности.

При вычислении кумулятивных данных мышей, павших от более высокого разведения, прибавляют к числу погибших от более низкого разведения. Мышей, оставшихся живыми от более низкого разведения, прибавляют к числу животных, не погибших от более высокого разведения (направление показано стрелкой). После получения кумулятивных данных определяют % летальности. Процент летальности для каждого разведения вычисляют по формуле:

%летальности = Кол-во павших (кумулятивные данные)/Кол-во зараженных (кумулятивные данные) х 100

Разведения, при которых % летальности приближаются к 50%, называют высшей и низшей критической дозой.

ЛД50 определяют по формуле:

где ЛД50 - искомое разведения вируса; В - разведение, вызывающее гибель более 50% животных; b - процент летальности, соответствующий разведению В; а - процент летальности, соответствующий разведению, дающему гибель менее 50% животных; d - коэффициент разведения.

Титр вируса, выраженный числом с дробным показателем степени, обычно в таком виде и оставляют. Его можно легко превратить и в абсолютную величину с помощью таблицы антилогарифмов (4-х значные математические таблицы Брадиса). По таблице антилогарифмов находят абсолютное значение разведения, соответствующее 1 ЛД50.

20. Серологические исследования — это методы изучения антигенов или антител в биологическом материале больных, основанные на определенных реакциях иммунитета. Обнаружение в биологическом материале антител к возбудителю инфекции или антигенов позволяет установить причину заболевания.

Серологические исследования не обладают 100% специфичностью и чувствительностью при диагностике инфекционных заболеваний. Поэтому оценивать их результаты нужно с учетом клинической картины заболевания. Этим обусловлена необходимость использования для диагностики инфекции нескольких тестов, а также применение методов Western-blot, подтверждающих результаты скрининговых методов.

«Иммуноблоттинг (Вестерн-блот, Western-blot) является фактически конечным верификационным (подтверждающим) методом в цепи иммунологических исследований, которые позволяют сделать окончательное лабораторное заключение. Особенно важный данный тест для подтверждения или опровержения инфекционного заболевания (например, коклющ, боррелиоз и т.д.). Метод Вестрен-блота, как правило, необходим после обнаружения положительных антител класса IgG инфекционного процесса, т.к. именно в такой комбинации происходит более правильная лабораторная интерпретация результатов и дальнейшая тактика лечения пациента. Для постановки Вестерн-блота используют специальные нитроцеллюлозные полоски, на которые методом горизонтального и затем вертикального иммунофореза перенесены белки в порядке нарастания молекулярного веса. Антитела сыворотки пациента взаимодействует с белками в определенных зонах полоски, а дальше происходит ход реакции аналогичный иммуноферметному анализу (ИФА)»,- объясняет к.мед.наук, медицинский директор лаборатории

проведенного лечения после выздоровления пациента, а также обнаружение рецидива заболевания. Кроме того, серологические методы могут выявить такие заболевания как:

Дата добавления: 2019-09-02; просмотров: 138; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 345 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!