Работа 13. Изучение субклеточного распределения сукцинатдегидрогеназы (маркера митохондрий) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; 0,5 М раствор сукцината натрия в субстратном буфере; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2O рН 5,0 (среда Б); 0,02 М раствор феназинметасульфата*; 0,001 М раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ)**.
* Приготовление раствора феназинметасульфата. 12 мг вещества переносят в стеклянную пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой и перемешивают. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
** Приготовление раствора ДХФИФ. 17 мг вещества растворяют в колбе на 50 мл. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность сукцинатдегидрогеназы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по одной из следующих схем:
а) кинетическая схема определения активности.
| опыт | контроль | ||
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера | ||
| 200 мкл сукцината натрия на субстратном буфере | – | ||
| 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | ||
| 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ | ||
| Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С
| |||
| 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | ||
Смесь быстро перемешивают и немедленно переливают в кювету (l = 1 см), на секундомере отмечают время начала реакции. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм каждые 20 сек в течении 3 мин. Аналогичным образом измеряют снижение оптической плотности в контрольных пробах, не содержащих сукцината. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
б) стационарная схема определения активности.
| опыт | контроль | ||
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера | ||
| 200 мкл сукцината натрия на субстратном буфере | – | ||
| 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | ||
| 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ | ||
| Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С
| |||
| 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | 3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | ||
| Инкубация на водяной бане 30 мин при 37°С | |||
| 1 мл 1 н HCl | 1 мл 1 н HCl | ||
Затем пробы переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин про 4000 об/мин. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||||
| Анализируемые пробы | Оп. Кн.
| Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||||
| Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее | ||||||||||||||
| Аоп – Акн |
|
|
|
|
|
| ||||||||
| Количество сукцината |
|
|
|
|
|
| ||||||||
| Активность на 1 мг ткани |
|
|
|
|
|
| ||||||||
| Активность фракции в % от гомогената | 100% |
|
|
|
|
| ||||||||
| Количество белка на 1 мг ткани |
|
|
|
|
|
| ||||||||
| Белок в % от белка гомогената | 100% |
|
|
|
|
| ||||||||
| Относительная удельная активность фракций |
|
|
|
|
|
| ||||||||
Работа 14. Изучение субклеточного распределения глюкозо-6-фосфатазы (маркера микросомальной фракции) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,1 М цитратный буфер рН 6,5; 0,08 М раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф) в 0,1 М цитратном буфере****; 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); раствор молибдата аммония*; восстанавливающий раствор**; стандартный раствор фосфора (5∙10-5 М)***.
* Приготовление раствора молибдата аммония. 2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды; 14 мл конц. серной кислоты приливают к 200 мл воды. Разбавленную кислоту наливают в раствор молибдата и доводят объем до 1000 мл.
|
|
|
** Приготовление восстанавливающего раствора. К 1,8 г Na2SO3 приливают 11,3 мл 1 н HCl и 5 мл воды. Затем растворяют 25 мг 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислоты и доводят общий объем до 25 мл. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
*** Приготовление стандартного раствора фосфора. 68 мг КН2РО4 растворяют в 20 мл воды и добавляют 10 мл конц. серной кислоты и доводят объем до 1000 мл.
**** Приготовление раствора Г-6-Ф. 55 мг глюкозо-6-фосфата растворяют в 2 мл 0,1 М цитратного буфера рН 6,5. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность глюкозо-6-фосфатазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
| опыт | контроль 1 | контроль 2 |
| 100 мкл фракции | 100 мкл фракции | 100 мкл буфера |
| Инкубация 10 мин при 37°С | – | – |
| 100 мкл Г-6-Ф | 100 мкл буфера | 100 мкл Г-6-Ф |
| Инкубация 20 мин при 37°С | ||
| 2 мл 10 % ТХУ | ||
Центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. Далее в стеклянных пробирках производят смешение согласно схеме.
| опыт | контроль 1 | контроль 2 | стандарт |
| 1 мл надосадочной жидкости | 1 мл станд. р-ра фосфора | ||
| 5 мл раствора молибдата | |||
Затем в каждую пробирку через промежутки времени, необходимые для дальнейшего колориметрического измерения, приливают по 1 мл восстанавливающего раствора.
Каждую пробу оставляют на 15 мин при комнатной температуре и затем промеряют экстинкцию при 750 нм на ФЭК. Количество белка определяют по Лоури. Активность фермента выражают в ммолях фосфата, отщепленного за 1 мин инкубации на 1 мг белка.
Содержание отчета
1. Обоснуйте наличие в данной методике двух контролей и стандарта.
2. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы:
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
| Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее | ||||||||||||
| Аоп – Акн |
|
|
|
|
|
| ||||||
| Количество фосфата |
|
|
|
|
|
| ||||||
| Активность на 1 мг ткани |
|
|
|
|
|
| ||||||
| Активность фракции в % от гомогената | 100% |
|
|
|
|
| ||||||
| Количество белка на 1 мг ткани |
|
|
|
|
|
| ||||||
| Белок в % от белка гомогената | 100% |
|
|
|
|
| ||||||
| Относительная удельная активность фракций |
|
|
|
|
|
| ||||||
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 277; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!