Работа 8. Частичная очистка ФМСФ-КП из печени крыс методом гель-фильтрации
Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, стеклянные стаканы на 50 и 100 мл, колонка для гель-фильтрации высотой 15 см, шприц, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, сефадекс G‑75, 0,9% раствор NaCl, набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
Сефадекс G-75 суспендируют в 5-10 кратном объеме дистиллированной воды и оставляют для набухания на 3 часа. Затем перемешивают до однородной массы, дают отстояться. После оседания основной массы геля осторожно декантируют надосадочную жидкость с неосевшими обломками гранул. Суспендирование и последующую декантацию (отмучивание) повторяют 3-4 раза.
Колонку закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора NaCl, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию геля. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию геля прибавляют до тех пор, пока его высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 1 объемом NаС1.
|
|
|
100 мг печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. Центрифугированный гомогенат помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Открывают зажим колонки и сливают столб раствора NaCl, находящийся над сефадексом. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя, снова дают впитаться. Затем заполняют колонку раствором NaCl, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. С момента нанесения образца на колонку собирают 10 фракций объемом 1 мл.
Во 2, 4, 5, 6, 7, 9 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.
|
|
|
| Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
| – | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
| Преинкубация 8 минут при 37°С | |
| 50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
| Инкубация 30 мин при 37°С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех=360 нм, λем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури.
Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а = 
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
| Фракция | Гомогенат | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
| Активность | |||||||
| Степень очистки | 100% |
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 272; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!