Работа 10. Частичная очистка ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы из печени методом ионообменной хроматографии (на диэтиламиноэтилцеллюлозе)
Оборудование и реактивы: пробирки; автоматическая пипетка; гомогенизатор; стеклянные стаканы на 50 и 100 мл; колонка для ионно-обменной хроматографии высотой 15 см; шприц; набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой; гомогенизатор; 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6); 0,05 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH 6,0; 1 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH 3,7; спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ; диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭЦ); набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
Колонку для хроматографии закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 6,0, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию ДЭАЭЦ. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию ДЭАЭЦ прибавляют до тех пор, пока ее высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 20 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 6,0.
|
|
|
4 г печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 100 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 4,9 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Открывают зажим колонки и сливают столбик буфера, находящийся над гелем. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 6,0, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. Для удаления несвязавшихся белков колонку промывают 50 мл буфера.
Затем фермент элюируют 1 М натрий-ацетатным буфером с 0,05 М NaCl, pH 3,7. С момента этого буфера на колонку собирают 12 фракций объемом 2 мл.
|
|
|
Во 2, 4, 5, 6, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.
| Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
| – | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
| Преинкубация 8 минут при 37°С | |
| 50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
| Инкубация 30 мин при 37°С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробирки помещают в центрифуги и центрифугируют их 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех=360 нм, λем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб, не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а = 
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
|
|
|
| Фракция | Гомогенат | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
| Активность | |||||||
| Степень очистки | 100% |
| Фракция | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 | 22 | 24 |
| Активность | |||||||
| Степень очистки |
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 253; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!