Особенности микробного роста на жидких питательных средах.
ЗАНЯТИЕ 8
Тема: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.
РОСТ, РАЗМНОЖЕНИЕ, ДЫХАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АНАЭРОБОВ.
ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ ПО БИОХИМИЧЕСКИМ СВОЙСТВАМ.
Цель занятия: 1) изучить результаты первого дня выделения чистой культуры аэробов и продолжить ее выделение (2 день); изучить морфологию анаэробов, освоить методы культивирования анаэробов и методы выделения чистой культуры анаэробов.
2) изучить ферментативные (сахаролитические и протео-литические, гемолитические и редуцирующие) свойства микробов и другие методы обязательные для идентификации возбудителя; продолжить выделение чистой культуры аэробов и анаэробов (3 и 4 день)
План занятия (вопросы для обсуждения)
1. Рост и размножение микроорганизмов. Кривая роста микроорганизмов на жидкой питательной среде.
2. Дыхание микроорганизмов. Понятие об аэробах и анаэробах. Энергетический метаболизм.
3. Процессы окислительного и субстратного фосфорилирования у микроорганизмов с разным типом дыхания (сравнительная характеристика особенности аэробного и анаэробного дыхания).
4. Брожение и его разновидности.
5. Методы изучения чистой культуры аэробов (2 день). Идентификация бактериальной культуры по культуральным свойствам на жидкой и твердой питательных средах.
6. Методы культивирования анаэробов.
7. Методы выделения чистой культуры анаэробов.
|
|
|
8. Выделение чистой культуры микроорганизмов (продолжение).
9. Секреция продуктов жизнедеятельности микробной клетки: пигменты, аромат, газообразование, светящиеся микроорганизмы, микробные токсины.
10. Идентификация бактерий по биохимическим свойствам: сахаролитические, протеолитические, гемолитические, липолитические свойства. Редуцирующие (окислительно-восстановительные) свойства микробов.
11. Современные методы биохимической идентификации бактерий.
12. Выделение чистой культуры (3-4 дни: аэробы; 3-5 дни: анаэробы).
Оформление протокола лабораторного занятия (сделать дома)
Записать: тему и цель занятия.
2. Начертить таблицу 8.1, самостоятельно заполнить столбец «Возможные характеристики колоний», на занятии заполнить столбец «Характеристики выросших колоний» результатом своего посева.
3. Начертить Таблицу 9.1. для заполнения на занятии.
Задания для выполнения лабораторной работы
1. Учесть результаты первого дня выделения чистой культуры микроорганизмов аэробов и продолжить ее выделение (2 день):
а) описать морфологию колоний на чашках с МПА (табл. 8.1);
б) отобрать изолированные колонии;
|
|
|
в) из половины колонии сделать мазки, окрасить по Граму и оценить чистоту культуры;
г) пересеять исследуемую колонию на в пробирку скошенный агар для накопления чистой культуры.
2. По демонстрационным препаратам изучить «Методы культивирования анаэробов» - кратко описать методику.
3. По демонстрационным препаратам:
- определить сахаролитические и протеолитические ферменты микробов кишечной группы при посеве на «пестрый» ряд и МПБ с индикаторами;
- определить способность микроорганизмов вырабатывать ферменты: каталазу, оксидазу, плазмокоагулазу, гиалуронидазу;
- заполнить таблицу 9.1
4. Сделать фото всех демонстрационных препаратов для оформления в протокол самостоятельной работы.
Дополнительный материал
Методика изучения культуральных свойств микробов. Культуральные признаки микроорганизмов определяются характером роста их на плотных, жидких и полужидких питательных средах. Культуральные свойства характерны для каждого вида микроба и поэтому являются важным видовым признаком.
Рост микробов на плотной питательной среде. Чашки с посевами просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа, вверх дном и исследуют колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и суженой диафрагмой.
|
|
|
Колонии характеризуют по следующим признакам:
- размер
- форма
- прозрачность
- контур края
- рельеф
- поверхность
- цвет
- структура
- консистенция.
Размеры колоний определяются ее диаметром. В зависимости от диаметра различают колонии: точечные (диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1-2 мм), средние (диаметр 2-4 мм), крупные (диаметр 4-6 мм и более).
Форма колоний:круглая, овальная, ветвистая, амебовидная и др.
Характер контура края колоний: ровный, изрезанный, лопастный, локонообразный, бахромчатый и т.д.
Рельеф колоний характеризуется приподнятостью ее над поверхностью среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Рельеф колонии определяется невооруженным глазом или с лупой при рассмотрении ее сверху и сбоку. Различают колонии каплеобразные, куполообразные, конусообразные, с вдавленным центром.
Поверхность колоний: ровная или складчатая, матовая или блестящая, сухая или влажная и т.д.Важно определить тип колонии.
Различают два основных типа колоний бактериальной культуры:
колонии гладкие — S-тип (от англ. Smooth — гладкий), характеризующийся круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией;
|
|
|
колонии шероховатые — R-тип (от англ. Rough — шероховатый), характеризующийся шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S-форм в результате мутации.
Помимо этих двух основных типов колоний существует так называемый слизистый M-тип (от лат. Mucus — слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией. Образуется в процессе диссоциации бактериальных культур.
Прозрачность колоний: прозрачные или непрозрачные в разной степени.
Консистенция колоний: пастообразная, вязкая, слизистая, волокнистая, плотная, хрупкая, сухая и т.д. Консистенцию колонии определяют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериологической петлей.
Цвет колоний определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Красный цвет образуют некоторые актиномицеты, дрожжи, бактерии. Синий цвет характерен для синегнойной палочки, желтый и золотисто-желтый образуют стафилококки, сарцины. Черные и бурые пигменты вырабатывают некоторые грибы, азотобактер и другие микроорганизмы. Большинство патогенных бактерий пигмента не образуют, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета.
Таблица 8.1
Схема изучения колоний
| № | Признак | Возможные характеристики колоний | Характеристики выросших колоний |
| 1 | Форма и рельеф | ||
| 2 | Величина, мм | ||
| 3 | Характер поверхности | ||
| 4 | Цвет | ||
| 5 | Прозрачность | ||
| 6 | Характер краев | ||
| 7 | Внутренняя структура | ||
| 8 | Консистенция | ||
| 9 | Эмульгирование в капле воды |
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.
Рис.8.1. Форма и очертание края колоний на твердой питательной среде
Особенности микробного роста на жидких питательных средах.
Поверхностный рост: пристеночное кольцо, нежная пленка, грубая морщинистая пленка, поверхностный рост отсутствует.
Помутнение среды: слабое, умеренное, сильное, стойкое, отсутствует. Осадок: плотный, зернистый, вязкий, в виде клочка ваты, в виде хлопьев, крошковидный и т.д.
Количество осадка: обильное, скудное, отсутствует. Цвет среды: не изменен, изменен (приобретает окраску пигмента, образуемого микроорганизмом). Газообразование: наличие или отсутствие пузырьков газа.
Рост микробов на полужидкой питательной среде. Форма колоний: круглые, овальные, разветвленные. Размеры колоний: точечные, средние, крупные. Края: ровные, разорванные, лопастные, зубчатые. Поверхность: матовая, блестящая, ровная или складчатая. Разжижение среды: быстрое, медленное, отсутствует.
Особенности роста микроорганизмов по уколу. В верхней части растут аэробы, в нижней – анаэробы. Стержень: длинный, короткий, в виде плоской ленты и т.д. Боковые отростки: длинные, короткие, в виде ершика, елочки, елочки вершиной вниз и т.д. Разжижение среды: не разжижает, разжижает полностью, послойно, воронкой, кратером и т.д.
Газообразование: наличие или отсутствие пузырьков газа.
Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является создание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.
Физические методы
1. Кипячение среды - наиболее простой способ удаления растворенного кислорода. Непосредственно перед посевом материала пробирки с жидкими питательными средами кипятят на водяной бане в течение 15 – 20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Среду быстро охлаждают, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1,0–1,5 см). Засев среды проводят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.
2. Посев уколом в столбик питательной среды. Пробирку с питательной средой, застывшей в виде столбика, берут в левую руку и в центр столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом. Пробирку закрывают пробкой, в верхней третьей части подписывают. В штативах помещают в термостат для инкубирования.
3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из анаэростатов, анаэробных боксов с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азот, аргон, гелий).
Анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. В прибор помещают чашки с посевами, откачивают воздух, кран закрывают, ставят в термостат для культивирования анаэробов при определенной температуре. Для поглощения водных паров на дно анаэростата помещают 5-6 г хлористого кальция, 10-12 г силикогеля или 20-30 г хлористого натрия. Анаэробные условия в микроанаэростате могут быть созданы и при использовании коммерческих газогенерирующих пакетов для анаэробов (BioMerioux; Becton Dickinson).
4. Метод Вейон-Виньяля. В узкую стеклянную пипетку заливают расплавленный агар, смешанный с исследуемой микробной культурой. После чего пипетку запаивают с обоих концов парафином. Пипетку инкубируют одни сутки в термостате при температуре 37ºС. В расплавленном агаре микробная масса распределяется равномерно и по истечении времени инкубации образуются хорошо видимые на просвет изолированные колонии микроорганизмов. Пипетку просматривают, после чего производят распил пипетки в месте локализации отдельных колоний и забирают их бактериологической петлей для идентификации.
Химические методы
1. Метод Аристовского. Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри, после чего помещают их в эксикатор. На дно эксикатора кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфат натрия или пирогаллол (для поглощения кислорода из 220 мл воздуха применяют смесь, состоящую из 1 мл 20% раствора пирогаллола и 1 мл насыщенного раствора карбоната натрия – Na2CO3. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37ºС на 24-48 часов.
2. Применение редуцирующих веществ. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота, тиогликолят натрия (0,01–0,02%), аскорбиновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1–3%), цистин и цистеин (0,03–0,05%), муравьинокислый натрий (0,25–0,75%) и др.
Биологические методы
1. Метод Фортнера - совместное выращивание анаэробов и аэробов. На одну половину чашки Петри засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой заливают парафином.
2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают кислород, в результате в среде создаются анаэробные условия.
Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрывают резиновыми пробками.
Среда Китта-Тароцци (МПБ) используется для культивирования анаэробов. В ее состав входят мясо-пептонный бульон, 0,5% натрия хлорида, кусочки печени или мышц для адсорбции кислорода. Устанавливают рН 7,6–7,8. На поверхность среды тонким слоем наслаивают вазелиновое масло.
Дата добавления: 2019-02-22; просмотров: 1016; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!