Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов
Поскольку микроорганизмы по-разному относятся к молекулярному кислороду, это определяет и различия в способах их культивирования.
Культивирование аэробных микроорганизмов проводят следующим образом:
* на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха;
* в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование.
Культивирование анаэробных микроорганизмовболее сложно, чем выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для создания анаэробных условий используют различные приемы. Их подразделяют на физические, химические и биологические. Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве.
К физическим методам создания анаэробных условий относится культивирование в микроанаэростате - вакуумном аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с
5% СО2 и 10% Н2.
К химическим методам относится:
1) Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na2S2O4), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы.
|
|
|
2) Использование восстанавливающих агентов, которые добавляют в большинство сред для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, аскорбиновая кислота.
Как пример биологического способа создания анаэробных условий - выращивание совместно с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. Например, питательную среду в чашке Петри разделяют желобком на две половины, на одну половину засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой - анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется только после полного использования кислорода аэробом.
Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре:
* выращивание в высоком слое среды;
* выращивание в толще плотной среды;
* культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее плотности;
* заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина.
|
|
|
Методы количественного учета микроорганизмов
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по величине титра клеток.
Титр клеток (или фаговых частиц) - это количество клеток в единице объема.
Выбор метода для определения числа клеток зависит от:
1) цели исследования;
2) свойств питательной среды или субстрата;
3) особенностей роста и морфологии микроорганизмов.
Существуют методы, позволяющие определять: 1) общее количество микроорганизмов в исследуемом материале; 2) только количество жизнеспособных клеток.
С другой стороны, методы количественного учета микроорганизмов могут быть разделены на прямые и косвенные:
1) прямые методы - это методы прямого счета (микроскопические);
2) косвенные - а) основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (методы оптические (нефелометрия, спектрофотометрия и т.д.); б) методы подсчета колоний (методы высева).
Методы прямого подсчета клеток под микроскопом используют для определения общего количества микроорганизмов в различных материалах. Это такие методы как подсчет в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, на мембранных фильтрах.
|
|
|
Преимущества использования методов прямого подсчета клеток:
- широко применяются в исследованиях микрофлоры воды и почвы;
- эффективность такого подсчета, как правило, в 10 - 10000 раз выше, чем при подсчете методом высева, так как многие микроорганизмы не растут на питательных средах и учесть их можно только под микроскопом;
- позволяет определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых, либо эти группы клеток по отдельности);
- дает возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта;
- производится быстрее, более дешев, оборудование для его осуществления имеется в каждой лаборатории.
Основное ограничение большинства методов данной группы - необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.
Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом. Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит измерение количества света, рассеянного взвесью клеток. Величину светорассеяния измеряют с помощью нефелометров, спектрофотометров или фотоэлектроколориметров. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, падает на фотоэлемент. Обычно при этом сравнивается интенсивность света, проходящего через суспензию клеток и через среду без клеток. Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной взвесью. Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять количество клеток по рассеиванию, должна быть оптически прозрачной.
|
|
|
Определение количества жизнеспособных клеток путем высева на питательные среды (чашечный метод Коха). Сущность метода подсчета количества клеток путем высева заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на агаризованную питательную среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний, принимая во внимание, что каждая колония - потомство одной жизнеспособной клетки. Существует много вариантов метода:
· При посеве на поверхность агара (метод Коха). Проводят в три этапа: приготовление разведений исследуемого материала, посев на агаризованную среду в чашках Петри и подсчет сформировавшихся колоний.
· Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной до 450 агаризованной средой. Содержимое чашки перемешивают и дают среде застыть.
· Метод посева в тонком слое агаризованной среды предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 -3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.
Каждый из вышеперечисленных методов посева имеет свою область использования и определенные ограничения. При посеве на поверхность агаризованной среды все выросшие колонии являются поверхностными. Именно в этом случае изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. При посеве в агаризованные среды колонии, как правило, компактны и невелики по размерам, так как формируются под слоем агара, что дает возможность учета большего их количества. Вторым преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом среды: верхний и нижний слой могут содержать разные питательные добавки. Кроме того, к верхнему слою могут быть добавлены красители для облегчения обнаружения колоний.
Дата добавления: 2019-02-26; просмотров: 641; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!