Генодиагностика. Используемые реакции. Достоинства и недостатки метода.
Генодиагностика, ДНК-ДИАГНОСТИКА – совокупность методов по выявлению мутаций, приводящих к наследственной патологии.
Методы: прямые и косвенные
· С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100 %.
Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях:
1) известной локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания,
2) должен быть клонированным ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность.
Цель: идентификация мутантных аллелей (нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, мутации и их типы).
Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена и спектра его мутаций. Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона.
· Косвенные методы ДНК-диагностики основаны на анализе сцепления с исследуемым геном определенного полиморфного локуса (маркера), с помощью которого можно производить маркировку как мутантных, так и нормальных аллелей и проанализировать их передачу в поколениях.
При использовании косвенных методов ДНК-диагностики следует помнить — чем теснее сцепление между маркерным локусом и мутантным геном, тем точнее диагноз.
|
|
|
Чтобы свести до минимума ошибку диагностики, необходимо по возможности использовать внутригенные маркеры.
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть определена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК,
Метод ПДРФ-анализа включает проведение нескольких этапов исследования:
1. Выделение геномной ДНК;
2. Рестрикция выделенной ДНК с помощью специфических эндонуклеаз;
3. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК;
4. Идентификация фрагментов ДНК, содержащая полиморфный сайт рестрикции При отсутствии рестрикции ДНК по данным радиоавтографии будет выявляться крупный (неразрезанный фрагмент, или бэнд).
Использование: 1) когда ген не идентифицирован, а лишь картирован на определенной хромосоме, 2) когда методы прямой ДНК-диагностики не дают результата (например, в силу большой протяженности гена или широком спектре мутационных изменений, 3) при сложной экзонно-интронной организации гена.
Н-р: Дородовая диагностике наследственного заболевания
ДНК-диагностику используют в следующих случаях:
· Медико-генетическая консультация при наследственных заболеваниях.
· Установление биологического родства. Экспертиза позволяет со 100 %-ной вероятностью исключить отцовство (материнство) или с вероятностью не ниже 99,99 % установить наличие биологического родства.
|
|
|
· Диагностика к предрасположенности к некоторым заболеваниям, таким как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, эссенциальная гипертензия, остеопороз, сахарный диабет, бронхиальная астма, рак и пр.
· Диагностика некоторых форм бесплодия и невынашивания беременности
· Определение ДНК возбудителя при различных бактериальных и вирусных инфекциях.
Используемые реакции
· Секвенирование: методы, позволяющие установить последовательность нуклеотидов в ДНК
· ПЦР (полимеразные цепные реакции):
Принцип:
1. Исследуемый материал обрабатывают => лизис клеток и выход ДНК возбудителя.
2. Перенос материала в пробирку с мононуклеотидами (ДНК-полимеразой и праймером)
3. Циклическое изменение температуры => репликация генов возбудителя (амплификация)
Выявление ДНК электрофорезом или флуоресцентным методом
Важнейшим преимуществом ПЦР перед другими методами, в том числе молекулярно-биологическими, является ее высокая чувствительность, позволяющая определять единичные молекулы инфекционных патогенов.
|
|
|
Применение: можно диагностировать не только острые инфекции, но и хронические и латентные инфекции, а также заболевания со стертой, нетипичной клинической картиной.
Достоинства:
1. ПЦР следует отнести высокую специфичность исследований (точность в обнаружении искомого генетического материала),
2. Возможность выявления возбудителей в довольно короткие сроки (от 6 до 48 ч).
· ПЦР в режиме реального времени
Используются флуор. Меченые праймеры или ДНК-зонды для измерения точного количества продукта реакции
Достоинства:
Возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в материале, менее строгие требования к организации лабортароии, отсутствие электрофореза, автоматическая регистрация результатов
Дата добавления: 2019-02-26; просмотров: 720; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!