Бактериофаги. Получение. Титрование.
Производство бактериофагов:
Получают БФ в основном из лизогенных структур м/о или их окружающей среды, заражая материалом бактерии.
Активность определяется титрованием по методу Грациа или методом Аппельмана на жидких средах.
Титр бактериофага- наибольшее его разведение, вызывающее лизис мо
· Метод Грациа: (метод подсчета негативных колоний)
1. Смешать 1 мл фага с 0.5 мл бактериальной культуры В пробирке.
2. Добавить в пробирки расплавленный МПА.
3. Перелить все в чашу с МПА.
4. Оставить на время для застывания.
5. Поставить в термостат.
6. При встрече фага с бактерией происходит ее лизис образуется негативная колония фага.
7. Подсчет негативных колоний для определения титра.
Титром называют количество частиц фага в 1 мл препарата фага.
Достоинства:
· Возможно определение индекса титрования
· Точный метод
Реакторный способ культивирования:
1. Засевают в питательную среду маточный бактериофаг и посевную культуру бактерий.
2. Инкубирование 16-18 часов при температуре 37-38 градусов
3. По окончании фаголизиса Препарат подвергают осветляющей фильтрации с использованием одноразовых фильтрующих элементов.
4. Ультрафильтрация - для освобождения фаголизата от продуктов жд бактерий, токсинов.
· Метод Аппельмана (для количественного определения БФ):
· В пробирки МПБ вносят индикаторную культуру и по 1 мл фагов.
· Инкубация
· Учет «+» - лизис индикаторной культуры; «-» рост индикаторной культуры (помутнение среды)
|
|
|
· Подготовка на жидкой питательной среде десятичных разведений препарата до 10^(-1)-10^(-8)
Применение бактериофагов.
· Диагностика:
1. Фагоиндикация (дифференцировка): определение соответствующих бактерий в материале основано на специфичности лизиса этих мо данными БФ.
2. Фаготипирование: метод основан на чувствительности нескольких групп бактерий к одному виду фагов, такие группы обладают одинаковым фаготипом, что свидетельствует об общности происхождения данных групп.
· Фаготерапия нельзя внутривенно/внутримышечно, т.к. образуются АТ (например: синегнойные инфекции, сальмонеллез, протейная инфекция, газовая гангрена, полиэнтериты, стафил. инфекции)
· Фагопрофилактика – обработка ран и полостей (например: холера, дизентерия, брюшной тиф)
· Уничтожают бактерии, устойчивые к антибиотикам
· Ветеринария
· Генная инженерия: умеренные БФ играют роль типичных плазмид; трансдукция -векторыдляпереносаматериала
· Пищевая промышленность: обработка продуктов, применение в производстве продуктов.
Геном бактерий. Особенности организации и функционирования нуклеоида.
· Простота строения генома, позволяет выявляет мутанты с частотой 10 ^-9 и ниже.
|
|
|
· Гаплоидный набор хромосом – исключает доминантность; удвоение сопровождается делением клетки
· Имеются обособленные и интегрированные ДНК (плазмиды, тарнспозоны)
· Легко культивируются
Геном бактериальной клетки (генотип) определяет ее проявляющиеся и потенциальные свойства и признаки
Исключения: Brucella melitensis (2 хромосомы), Leptospira inerrogans (кольцевая хромосома и одна большая плазмида), Streptomyces ambofaciens(линейная хромосома)
Генетический аппарат
1. Нуклеоид – 1 замкнутая кольцевая ДНК (до 4000 отдельных генов)
2. Внехромосомные молекулы ДНК – плазмиды или мобильные элементы
Бактериальная хромосома содержит до 10 ^7 пар оснований (у человека 2,9*10^9)
Хромосома в суперспирализированной форме и свернута в виде петель (12-80), петли связываются с РНК (сердцевинная структура)
Хромосома удваивается перед делением, сестринские копии распределяются по дочерним клеткам с помощью мезосомы.
В хромосому бывают встроены мигрирующие элементы, способные осуществлять транспозицию с помощью транспоназы (фермент) внутри генома (с помощью фагов и плазмид в качестве переносчиков)
Репликация начинается в точке Ори и заканчивается в точке TerC.
|
|
|
Репликация
Инициация.
Элонгация
Терминация
Стадии:
· Разделение (геликаза) цепей раскручивание (топоизомераза)
· Синтез РНК – праймера (DNK праймаза)
· Синтез цепи ДНК (ДНК- полимераза III, Лигаза)
Репарация – восстановление повреждённой цепи ДНК
Мигрирующие элементы
1. Встраивающиеся последовательности: IS- элементы:
· Не реплицируются самостоятельно
· Не содержат гены, отвечающие за фенотипические проявления
· Содержащиеся в них гены обеспечивают только перемещение между участками хромосомы
· Обеспечивают ДНК-полиморфизм и внутривидовое разнообразие
Функции:
· Регуляция активности генов бактериальной клетки
· Вызывают дупликации ДНК, делеции, инверсии
2. Транспозоны: содержат специфические гены, ответственные за важные для бактерий свойства (н-р: резистентность)
· Неспособны к самостоятельной репликации, размножаются в составе хромосомы;
· Вызывают делеции, инверсии, дупликации
3. Интегроны: система захвата малых элементов ДНК – генных кассет и их экспрессии.
Состав:
· Ген, кодирующий интегразу;
· Сайты рекомбинации;
· Промотор Р;
· Гены антибиотикорезистнтности – кассеты генов, не имеющих собственных промоторов и использующих при экспрессии промотор интегрона
|
|
|
Дата добавления: 2019-02-26; просмотров: 607; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!