Работа 98. Качественное определение индикана в моче
Реактивы. Свинца ацетат (100 г/л); железо хлорное; кислота соляная концентрированная, пл. 1,19; реактив Обермейера; 0,2-0,4 хлорного железа и 100 мл концентрированной соляной кислоты; хлороформ.
Материал. Моча свежевыпущенная.
Принцип метода основан на способности индикана с реактивом Обермейера в присутствии хлороформа окрашиваться в синий или красный цвет.
Ход определения. 1 мл мочи смешивают с раствором ацетата свинца в отношении 1:10, фильтруют. Смешивают 1-2 мл фильтрата с реактивом Обермейера в соотношении 1:1, прибавляют 0,5-1,0 мл хлороформа и опрокидывают пробирку несколько раз. Если слой хлороформа окрашивается в синий или красный цвет, то проба положительная.
Оформление работы. По полученному окрашиванию сделать вывод о возможности использования данной реакции в диагностике патологических процессов.
Практическое значение работы. В норме индикан содержится в моче в незначительном количестве и не обнаруживается качественными пробами. Индиканурия встречается при интенсивном гниении белковых веществ в кишечнике, а также при усиленном распаде белков в организме.
Работа 99. Обнаружение некоторых пигментов в моче.
Реактивы. Бензидин, 1%-ный раствор в 32%-ной уксусной кислоте; пероксид водорода, 3%-ный раствор; иод, 1%-ный спиртовой раствор.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 5 мл.
|
|
|
Материал. Моча, нормальная и патологическая*.
а. Бензидиновая проба на кровяные пигменты в моче. Принцип метода см. работу 9, а.
В одну пробирку вносят 5 капель нормальной, а в другую – патологической мочи и добавляют по 3 капли бензидинового реактива и раствора пероксида водорода. При наличии пигментов появляется сине-зеленая окраска.
б. Проба Розина на желчные пигменты в моче. Метод основан на образовании из билирубина под действием иода биливердина, окрашенного в зеленый цвет.
Ход определения. В одну пробирку вносят 5 мл нормальной, а в другую – патологической мочи и осторожно наслаивают раствор иода. Если в моче присутствует билирубин, на границе двух жидкостей появляется зеленое кольцо.
МЕТАБОЛИЗМ КСЕНОБИОТИКОВ
Метаболизм ксенобиотиков осуществляется с участием ферментов, содержащихся в тканях и жидкостях организма. Их состав определяет специфичность превращения любого чужеродного соединения. Метаболизм ксенобиотиков зависит от пути поступления их в организм. В пищеварительном тракте возможен гидролитический распад чужеродных веществ, в биологических жидкостях они подвергаются и некоторым другим превращениям (оксидоредукции, конъюгации), а в клетках происходят самые разнообразные реакции биотрансформации ксенобиотиков (см. учебник, с.444-455).
|
|
|
Наиболее активно ферментативные превращения ксенобиотиков осуществляются в клетках печени. Среди них следует отметить реакции окисления веществ, осуществляемые монооксигеназной ферментативной системой мембран эндоплазматической сети (микросом) печени. В микросомальной цепи протекают окислительные реакции двух типов: реакции гидроксилирования природных (аутобиогенных) и чужеродных соединений и реакции пероксидного окисления ненасыщенных жирных кислот (А.И.Арчаков, 1975).
Для исследования метаболизма ксенобиотиков возможны два подхода:
1) определение состава и содержания метаболитов введенных ксенобиотиков в биологических жидкостях и экскретах;
2) определение активности ферментов, участвующих в превращении ксенобиотиков, и изучение кинетики действия данных ферментов на различные соединения.
В экспериментах применяют оба подхода; в клинике метаболизм лекарственного средства оценивают, как правило, по содержанию в биологических жидкостях изучаемого вещества и его продуктов обмена.
1. Исследование процессов окисления
|
|
|
и конъюгации ксенобиотиков
Работа 100. Выявление дыхательной активности микросом
Дыхание микросом – процесс окисления веществ кислородом с образованием воды – можно изучать или по скорости потребления кислорода, или по использованию восстановленного НАДФ, или НАД, участвующих в этих реакциях.
Реактивы. Хлорид калия, 1,15%-ный раствор; трис-буфер, 0,1 М раствор с рН 7,4*; хлорид кальция, 0,04 М раствор; НАДФ·Н, 1,0 мМ раствор, свежеприготовленный; НАД·Н, 1,0 мМ раствор, свежеприготовленный.
Оборудование. Пипетки вместимостью 0,1; 1; 5; 10 мл; штатив с пробирками; стеклянные палочки; чашки Петри; мерный цилиндр вместимостью 25 мл; фильтровальная бумага; шприц с иглой; гомогенизатор с пестиком из тефлона; аптечные весы с разновесами; моторчик для гомогенизации; флуороскоп; центрифуга ЦЛР.
Материал. Печень (свежая) забитого животного.
а. Выделение микросомальной фракции из печени крысы. Метод основан на разной скорости осаждения субклеточных частиц печени при центрифугировании в зависимости от их размера и плотности. Для уменьшения фактора осаждения микросом добавляется хлорид кальция, вызывающий их преципитацию.
|
|
|
Ход определения. После забоя животного печень отмывают от крови раствором хлорида калия из шприца, обсушивают ее фильтровальной бумагой и помещают в чашку Петри, стоящую на льду.
3 г ткани печени измельчают ножницами и переносят в стакан гомогенизатора, куда предварительно наливают 9 мл охлажденного раствора хлорида калия. Стакан помещают в лед и размельчают ткань с помощью тефлонового пестика при 1000 об/мин, делая 15-20 движений стаканом вверх-вниз.
Гомогенат разливают в две центрифужные гильзы и центрифугируют на ЦЛР при 10000g в течение 20 мин при 0-4˚С. Надосадочную жидкость сливают в другие центрифужные гильзы, прибавляют к ней раствор хлорида кальция в соотношении 1:5 по объему. Перемешивают и вновь центрифугируют при 3000g в течение 15 мин при 0-4˚С.
Надосадочную жидкость сливают. К осадку, содержащему обогащенную фракцию микросом, добавляют 3 мл раствора трис-буфера и с помощью пипетки, втягивая и выдувая жидкость, получают взвесь микросом.
б. Обнаружение дыхательной активности микросом печени флуориметрическим методом. Метод основан на наблюдении за скоростью падения флуоресценции НАДФ·Н или НАД·Н в процессе их окисления препаратами микросом.
Ход определения. В две пробирки наливают по 2,8 мл трис-буфера. Затем в одну из них добавляют 0,1 мл полученной взвеси микросом, а в другую – 0,1 мл дистиллированной воды (контрольная проба).
Ставят обе пробирки в штатив предварительно включенного флуороскопа, вносят в них по 0,1 мл раствора НАДФ·Н или НАД·Н и быстро перемешивают стеклянной палочкой.
Наблюдают за изменением флуоресценции в обеих пробах.
Оформление работы. По изменению флуоресценции указать на наличие дыхательной функции микросом.
Практическое значение работы. Выделение микросом используется в научных исследованиях для изучения их функций, в том числе дыхательной, при различных физиологических состояниях и при патологии, а также для исследования действия лекарств и ядов.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 650; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!