Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена
Работа 71. Выявление пентозурии пробой Биаля
Пентозурия возникает из-за недостатка белка, участвующего в транспорте пентоз и способствующего их реабсорбции в канальцах почек.
Реактивы. Орциновый реактив*.
Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; пипетки вместимостью 5 мл.
Материал. Моча, нормальная и патологическая*.
Принцип метода см. работу 16, б.
Ход определения. В две пробирки отмеривают по 5 мл орцинового реактива и по 1 мл соответственно нормальной и патологической мочи. Затем осторожно нагревают на водяной бане до закипания. При наличии в моче пентоз развивается яркая желто-зеленая окраска.
Оформление работы. Сравнить окраску проб нормальной и патологической мочи и сделать вывод о возможности использования данной реакции для диагностики пентозурии.
Работа 72. Выявление фруктозурии пробой Селиванова
Реактивы. Резорцин, 0,05%-ный раствор в 20%-ной соляной кислоте.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 2 мл; водяная баня.
Материал. Моча, нормальная и патологическая*.
Метод основан на превращении фруктозы при нагревании и в присутствии соляной кислоты в гидроксиметилфурфурол, который конденсируется с резорцином, образуя соединение красного цвета.
Ход определения. В две пробирки наливают по 1 мл раствора резорцина и добавляют в одну из них 2 мл нормальной, а в другую – патологической мочи. Обе пробирки нагревают в водяной бане до закипания. При наличии в моче фруктозы появляется интенсивное красное окрашивание. Оценку пробы производят в момент закипания; при более длительном нагревании положительную реакцию может дать и глюкоза.
|
|
|
Оформление работы. Сравнить окраску исследуемых проб и сделать вывод о практическом применении пробы Селиванова.
Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробой
С толуидиновым синим на мукополисахариды
Мукополисахаридозы – врожденное нарушение обмена кислых гетерополисахаридов. При этом заболевании появляются мукополисахариды в моче. Аналогичное явление наблюдается также при ревматоидном артрите и других повреждениях соединительной ткани.
Реактивы. Толуидиновый синий, 0,1%-ный раствор в водном ацетоне, разведенном с водой в соотношении 4:1; уксусная кислота, 10%-ный раствор.
Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х20 мм; глазные пипетки.
Материал. Моча, нормальная и патологическая*.
Метод основан на образовании окрашенных продуктов (пурпурного цвета) при взаимодействии мукополисахаридов с толуидиновым синим в кислой среде.
|
|
|
Ход определения. На одну полоску фильтровальной бумаги наносят каплю нормальной мочи, на вторую – каплю патологической. Полностью высушивают их при комнатной температуре и помещают в раствор толуидинового синего. Через 1 мин бумажки вынимают из красящего раствора и отмывают в растворе уксусной кислоты.
Проба положительна при развитии пурпурной окраски, говорящей о наличии мукополисахаридов в моче.
Оформление работы. Отметить наличие окрашивания, сделать вывод о возможности практического использования данной пробы.
Практическое значение работы. Полуколичественные методы анализа субстанций называются «просеивающими» или скрининг-тестами. Они позволяют осуществлять отбор больных с предполагаемыми наследственными или приобретенными дефектами обмена; их применяют при массовом обследовании больших контингентов детей для выявления наиболее распространенных и новых молекулярных болезней, при которых повышено выделение углеводов и продуктов их обмена. Эти вещества дают положительные реакции при проведении скрининг-тестов. В дальнейшем при выявлении молекулярной патологии проводится тщательное биохимическое обследование с помощью точных количественных методов.
|
|
|
Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче
Реактивы. Реактив Эрлиха*, насыщенный раствор натрия ацетата; хлороформ; бутиловый спирт; бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0-5,0).
Оборудование. Пипетки на 5,0 и 10 мл; штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными пробирками.
Материал. Моча (подвергается исследованию в течение 2-3-х часов после мочеиспускания).
Метод основан на взаимодействии порфобилиногена с п-диметиламинобензальдегидом с образованием соединения, окрашенного в красный цвет.
Ход определения. В пробирке смешивают 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия и перемешивают стеклянной палочкой. Затем измеряют рН индикаторной бумагой, значение рН должно быть в интервале 4,5-5,0, если рН меньше 4,0 добавляют раствор ацетата натрия для установления нужного рН. Если окраска не образуется – результат отрицательный. При образовании розовой или красной окраски добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний водный слой становится бесцветным или желтым – результат отрицательный. При сохранении окрашивания водной фазы переносят 6-8 мл водного слоя в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 2:1 и встряхивают. Обычно фазы разделяются быстро, в противном случае смесь центрифугируют. При переходе окраски в бутиловый слой результат отрицательный, а если водная фаза остается окрашенной – результат положительный для порфобилиногена.
|
|
|
Примечание . При хранении мочи свыше 3-х часов при комнатной температуре реакция может быть ложноотрицательной, что, по-видимому, связано с превращением порфобилиногена в порфирины и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2-3 часа, ее хранят в холодильнике при 4˚С или в замороженном состоянии. При хранении в холодильнике и доведении рН мочи до 6,0-7,0 порфобилиноген стабилен длительное время.
Оформление работы. Отметить характер развившегося окрашивания, сделать вывод о возможности практического использования данного определения.
Практическое значение работы. В норме порфобилиноген в моче не обнаруживается (0,2 мг/л). Данным методом он выявляется при концентрации, превышающей 6 мг/л ) при различных формах печеночных порфирий – острая перемежающая, копропротопорфирия, наследственная копропорфирия).
Работа 75. Количественное определение содержания
дельта-аминолевулиновой кислоты в моче
Реактивы. Уксусная кислота ледяная; хлорная кислота 57%; натрия ацетат 3-х водный; дельта-аминолевулиновая кислота гидрохлорид; уголь активированный с дисперсностью 0,25-1 мм; ацетил-ацетон; п-диметиламинобензальдегид; ацетатный буфер рН 3,6*; взвесь угля*; реактив Эрлиха*; беззольные фильтры (синяя лента), калибровочный раствор*.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки вместимостью 0, 1, 2,0 и 10 мл; пробирки с притертыми пробками; спектрофотометр.
Материал. Моча. Хранится в холодильнике, рН мочи должен быть равен 6,0, для чего добавляют на 10 мл мочи 0,1 мл ледяной уксусной кислоты.
Метод основан на способности дельта-аминолевулиновой кислоты взаимодействовать с п-диметиламинобензальдегидом после удаления порфобилиногена и других мешающих определению веществ с помощью активированного угля. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации данной кислоты в пробе.
Ход определения. К 1 мл мочи в пробирке с притертой пробкой добавляют 9 мл взвеси активированного угля в ацетатном буфере рН 3,6. Суспензию взбалтывают 1 минуту и фильтруют через бумажный фильтр. В две пробирки (контрольную и опытную) отбирают по 2 мл фильтрата. В опытную пробу добавляют 0,05 мл ацетилацетона, в контрольную – такое же количество ацетатного буфера. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем пробирки помещают на 20 минут в кипящую водяную баню, охлаждают, доводят объем жидкости ацетатным буфером до 2 мл и в каждую пробирку добавляют по 2 мл реактива Эрлиха, перемешивают. Через 15 минут спектрофотометрируют опытную пробу против контрольной при длине волны 553 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска раствора стабильна в течение часа.
Расчет. Содержание дельта-аминолевулиновой кислоты проводят по калибровочному графику, условия построения которого представлены в таблице.
| №№ пробирки | Рабочий калибровочный раствор, мл | Ацетатный буфер рН 3,6, мл | АЛК в пробе (2 мл) | |
| мкг | мкмоль | |||
| 1 | 0,1 | 4,9 | 0,04 | 0,0003 |
| 2 | 0,3 | 4,7 | 0,12 | 0,0009 |
| 3 | 0,5 | 4,5 | 0,20 | 0,0015 |
| 4 | 0,7 | 4,3 | 0,28 | 0,0021 |
| 5 | 1,0 | 4,0 | 0,40 | 0,0030 |
| 6 | 2,0 | 3,0 | 0,80 | 0,0060 |
Из каждой пробы отбирают по 2 мл раствора в две пробирки (контрольную и опытную), которые обрабатывают как указано выше. По полученным данным строят калибровочный график.
Расчет. При расчете рекомендуется проводить пересчет на 1 г креатинина, т.к. диурез за сутки может быть различным.
Содержание АЛК в моче рассчитывают по формуле с использованием калибровочного графика:
С·10
АЛК = ————— ,
А·2
где С – количество АЛК в пробе (мкмоль), найденное по калибровочному графику;
А – содержание креатинина в пробе (г);
10 – коэффициент разведения мочи;
2 – объем фильтрата (мл).
Коэффициент пересчета микрограмм АЛК в микромоли – 0,0076.
Оформление работы. По полученным экстинкциям сделать расчет содержания дельта-аминолевулиновой кислоты и вывод о причине возможных изменений.
Практическое значение работы. В норме содержание АЛК в моче 3,9-19 мкмоль/г креатинина (0,52-2,5 мг/г креатинина). Выделение аминолевулиновой кислоты с мочой увеличивается при патологических процессах, связанных с нарушением порфиринового обмена, а также при интоксикации свинцом, бензолом и другими токсическими веществами.
Работа 76. Количественное определение содержания копропорфирина
в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона
Реактивы. Уксусная кислота ледяная; эфир медицинский; соляная кислота 1,4 моль/л; йод, спиртовой раствор 0,039 моль/л; раствор йода в соляной кислоте (200 объемов соляной кислоты и 1 объем спиртового раствора йода).
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 2,0 и 5,0; делительные воронки, спектрофотометр.
Материал. Свежевыделенная моча (срок хранения не более 3-х часов).
Метод основан на способности йода переводить копропорфириноген в копропорфирин, который определяется спектрофотометрически по разнице оптической плотности при трех длинах волн.
Ход определения. В делительную воронку вносят 2 мл мочи, 0,2 мл ледяной уксусной кислоты, 5 мл эфира и встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. К эфирному слою, содержащему копропорфирин и копропорфириноген, добавляют 5 мл раствора йода в соляной кислоте для перевода копропорфириногена в копропорфирин, встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз нижний слой переносят в пробирку, термостатируют при 37˚С, в течение 5 минут. Затем содержимое пробирки встряхивают и измеряют оптическую плотность раствора в кюветах с толщиной слоя 1 см при трех длинах волн: 380, 402 и 430 нм против 1,41 моль/л раствора соляной кислоты.
Расчет проводят по формуле:
[2·E402 – (E430 + E380)] ∙ 2,093·1,52 нмоль/г креатинина
КП = —————————————————————————————————————
А
где Е402, Е430, Е380 – оптическая плотность раствора при соответствующих длинах волн;
А – содержание креатинина в пробе (г);
1,52 – коэффициент пересчета микрограмм КП в наномоль;
2,093 – коэффициент для расчета содержания КП, предложенный Римингтоном.
Оформление работы. По полученным результатам сделать расчет содержания копропорфирина и сделать вывод о причине возможных изменений.
Практическое значение работы. В норме содержание копропорфирина в моче 30,5-122 нмоль/г креатинина (20-80 мкг/г креатинина). Повышение содержания копропорфириа в моче наблюдается при наследственной копропорфирии, острой перемежающейся порфирии, эритропоэтической уропорфирии, а также при циррозе, гепатите, свинцовой интоксикации.
РЕГУЛЯТОРЫ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ
К регуляторам метаболизма можно отнести витамины, гормоны, гормоноподобные вещества и медиаторы. Свою функцию они осуществляют посредством модификации активности ферментов или влияния на их количество в клетках. Поэтому при исследовании данной группы биологических соединений применяют как методы качественного и количественного анализа этих веществ и продуктов их обмена, так и оценку состояния системы регуляторов организма по их действию на соответствующие звенья метаболизма.
Исследование витаминов
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 339; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!