Экспрессия генов и её особенности
Cодержание
Введение……………………………………………………………………………………………………………………………………2
Глава 1. Обзор литературы……………………………………………………………………………………………………………...4
1.1.1. Регуляция экспрессии генов…………………………………………………………………......................................................................4
1.1.1.1. Экспрессия генов и её особенности……………………………………………………………………………………………………...4
1.1.1.2. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции…………………………………………............................................................6
1.1.1.3. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов…………………………………………………………………………………..7
1.1.2. Проблемы изучения транскриптома………………………………………………………….....................................................................8
1.2. Церебральная ишемия………………………………………………………………………………………………………………………..11
1.2.1. Реакция тканей на снижение уровня кровотока………………………………………………………………………………………….11
1.2.2. Клеточные реакции при ишемии головного мозга……………………………………………………………………………………….13
1.2.3. Глутамат-кальциевый каскад………………………………………………………………………............................................................17
1.2.4. Реакция генома на ишемию……………………………………………………………………………………………………………......19
1.2.5. Комплексины и их возможное участие в глутаматной эксайтотоксичности…………………………………………………………..21
|
|
|
1.3. Нейропротекция при ишемии……………………………………………………………………………………………………………….24
1.3.1. Семакс и PGP………………………………………………………………………………………………………………………………25
Глава 2. Материалы и методы исследования………………………………………………………………………………………..28
2.1. Объект исследования………………………………………………………………………………………………………………………...28
2.2. Методы исследования………………………………………………………………………………..............................................................31
2.2.1. Электрофоретическое разделение РНК…………………………………………………………………………………………………...31
2.2.2. Синтез одноцепочечной кДНК…………………………………………………………………….............................................................32
2.2.3. Подбор праймеров………………………………………………………………………………………......................................................33
2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-time PCR)……………………………………………………………………34
2.2.5. Анализ уровня экспрессии генов методом ОТ-ПЦР………………………………………………………………………………………35
Глава 3. Результаты……………………………………………………………………………………………………………………….39
3.1. Влияние ишемии на экспрессию гена Cplx 2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс…………………………………38
|
|
|
3.2. Влияние семакса на экспрессию гена Cplx 2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс…………………………………41
3.3. Влияние PGP на экспрессию гена Cplx 2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс……………………………………..43
Глава 4. Обсуждение результатов………………………………………………………………………………………………………..46
Выводы……………………………………………………………………………………………………………………………………….52
Список литературы…………………………………………………………………………………………………………………………53
Введение
Одной из задач медицины и физиологии является исследование возможности целенаправленного влияния на физиологические и биохимические процессы в клетках и тканях при возникновении патологий. Для этого необходимо понимать особенности функционирования генетического аппарата в разных условиях и при разных воздействиях. Ишемический инсульт является повреждающим фактором, заметно нарушающим функционирование мозга и существенно влияющим на экспрессию генов в головном мозге. Нарушения при ишемическом инсульте провоцируются резким ухудшением мозгового кровотока, влекущим за собой кислородную и глюкозную недостаточность, нарушение протекания окислительно-восстановительных процессов в клетке, падение уровня АТФ, нарушение функционирования ионных каналов, изменение внутриклеточной среды, в конечном итоге – гибель нейронов. Почти в половине зарегистрированных случаев ишемический инсульт заканчивается летальным исходом, а из выживших пациентов большинство остаётся инвалидами. Поэтому поиск новых подходов для лечения ишемического инсульта является актуальной научной и медицинской проблемой.
|
|
|
Ключевым механизмом ишемического повреждения является процесс глутамат-кальциевого каскада, когда под влиянием гипоксии усиливаются процессы анаэробного гликолиза, внутриклеточная среда закисляется и нарушается активный ионный транспорт, что приводит к массивному высвобождению возбуждающих аминокислот глутамата и аспартата, в том числе в составе синаптических везикул.
К числу цитозольных белков, специфичных для нервной ткани и регулирующих процесс экзоцитоза, относятся комплексины. Анализ экспрессии генов комплексинов может помочь уточнить их роль в развёртывании глутаматной эксайтотоксичности.
|
|
|
В настоящее время для лечения ишемического инсульта широко используется нейропротекторный препарат семакс, разработанный в Институте молекулярной генетики РАН. Семакс – синтетический гептапептид (метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин). N-конец данного гептапептида содержит фрагмент адренокортикотропного гормона (АКТГ 4-7), а С-конец – трипептид пролил-глицил-пролин (PGP), который препятствует взаимодействию молекулы семакса с эндогенными эндопептидазами. Имеются научные данные о том, что PGP обладает также самостоятельным регуляторным действием. Исследование свойств семакса при церебральной ишемии у крыс, а также исследование эффектов препарата на клеточных культурах in vitro показывают, что применение семакса уменьшает степень выраженности патологии. Однако до конца молекулярный механизм действия этого нейропептида не ясен. Изучение экспрессии генов в условиях экспериментальной ишемии мозга и введения препарата семакс позволяет не только уточнить детали патологического процесса, но и оценить эффективность терапевтических процедур.
Целью данной работы является анализ изменения экспрессии гена комплексина-2 (Cplx2), вызванных ишемией головного мозга, а также введением регуляторных пептидов семакс и PGP. Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Проанализировать качество препаратов тотальной РНК, выделенных из мозга экспериментальных животных, ситезировать на их основе препараты кДНК.
2. При помощи метода ОТ-ПЦР оценить изменение относительного содержания альтернативных транскриптов гена Cplx2 в лобных долях коры и в подкорковых структурах головного мозга крыс в результате действия фокальной ишемии, а также введения препаратов семакс и PGP
Глава 1. Обзор литературы
1.1.1. Регуляция экспрессии генов
Экспрессия генов и её особенности
Экспрессия генов – биологический процесс, в ходе которого наследственная информация, содержащаяся в ДНК, реализуется в виде функционального продукта – РНК или белка. РНК образуется в результате транскрипции ДНК и в большинстве случаев является конечным функциональным продуктом: рибосомные, транспортные, микроРНК, малые ядерные РНК (мяРНК), малые интерферирующие РНК и другие, которые можно условно объединить под именем некодирующих РНК. Кодирующие (матричные, информационные) РНК служат матрицей для синтеза полипептидной цепи в ходе трансляции.
Экспрессия генов не ограничивается этапами транскрипции и трансляции. Процесс преобразования наследственной информации в конечный продукт включает также посттранскрипционные изменения, а в том случае, если конечным продуктом является белок, нередко также посттрансляционые изменения. В результате этих процессов происходят структурные преобразования РНК (посттранскрипционные изменения) или белка (посттрансляционные изменения), необходимые для адекватного осуществления их функций.
Посттранскрипционные изменения РНК включают в себя альтернативный сплайсинг, удаление интронов, кэпирование мРНК, добавление поли-А конца к ней же, транспортировку РНК в соответствующий компартмент клетки, посттрансляционную деградацию.
Посстрансляционные модификации – это ковалентные модификации белка после завершение синтеза полипептидной цепи. К посттрансляционным изменениям относятся гликозилирование, алкилирование и N-ацилирование, фосфорилирование и др., также ограниченный протеолиз, который происходит при созревании молекулы инсулина [1]. Образование дисульфидных мостиков внутри или между полипептидными цепями тоже относится к посттрансляционным модификациям. Модификации, вероятно, подвергается большинство белков [2], причём один и тот же белок, по всей видимости, может подвергаться разным типам модификации, что влияет на его функции. Существуют заболевания, причиной которых являются нарушения системы посттрансляционной модификации различных белков.
Посттранскрипционные (альтернативный сплайсинг) и посттрансляционные модификации обеспечивают огромное разнообразие белков в пределах клетки, ткани или организма.
Кроме того, сама доступность определённого участка ДНК для транскрипции зависит от множества факторов, таких как: нуклеотидная последовательность участка, распределение метилированных участков, взаимодействие с факторами транскрипции и другими белками, связанными с транскрипционной активностью, а также модификация гистонов (степепь их модификации: моно-, ди-, триметилирование и др. [3]) и других белковых комплексов, ассоциированных с ДНК [4]. Вообще состояние хроматина весьма лабильно, а изменение его конфигурации влияет на взаимодействие транскрипционных факторов и активных элементов генома.
В ходе клеточной дифференциации (от тотипотентных к специализированным клеткам) большая часть генома репрессируется. В работе Guelen и соавторов [5] было прослежено взаимодействие между хроматином и беками ядерной мембраны в фибробластах человека, определяющее редуцирование экспрессии значительной области генома. Также была показана роль химической модификации гистонов (в частности ацетилирования) в регуляции состояния хроматина на том или ином этапе клеточного цикла [6].
Дата добавления: 2018-10-25; просмотров: 420; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!