Глава 2. Материалы и методы исследования
2. 1. Объект исследования
Исследования выполнены на крысах-самцах линии Wistar 2-х месячного возраста, массой 250 – 350 г, содержащихся в виварии при естественном освещении и имеющих свободный доступ к пище и воде. Все крысы (n=60) были разделены на 4 группы: 1-я – ложнооперированные животные, которым вводили физиологический раствор, 2-я – животные после окклюзии левой средней мозговой артерии, которым вводили физиологический раствор (n=15); 3-я – животные, которых подвергали окклюзии левой средней мозговой артерии и вводили препарат семакс (n=15); 4-я – животные, которых подвергали окклюзии левой средней мозговой артерии и вводили препарат PGP (n=15); Экспериментальные группы были разделены на 3 подгруппы в зависимости от временной точки (3, 24 и 72 часа) и состояли не менее чем из четырех животных.
Дистальная окклюзия средней мозговой артерии у крыс
Рисунок 2.1. Схема эксперимента
Использованная нами экспериментальная модель фокальной ишемии мозга крыс была отработана и выполнена в совместной работе с сотрудником кафедры фармакологии Факультета Фундаментальной Медицины МГУ О. В. Поваровой [141].
Фокальную ишемию мозга у экспериментальных животных вызывали с помощью коагуляционной окклюзии дистального участка (выше места ответвления a. lenticulostriatis) левой средней мозговой артерии. Операцию проводили под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг, внутрибрюшинно). Для каждой временной точки (3, 24 и 72 часа) в качестве положительного контроля использовали группу ложнооперированных крыс. Таких животных под наркозом подвергали аналогичной процедуре подготовки операционного поля с левой стороны, но не производили коагуляцию артерии. Через 15 мин, 1 час, 4 часа и далее через каждые 4 часа крысам внутрибрюшинно вводили один из препаратов: семакс, PGP или физиологический раствор. Семакс использовали из расчета 10 мкг/100 г веса крысы; PGP – 3.75 мкг/100 г. Через 3, 24 и 72 часа крыс декапитировали под действием эфирного наркоза.
|
|
|
Из мозга крыс выделяли лобно-теменную долю коры и соответствующие ей подкорковые структуры (Рис. 5). Ткани замораживали в жидком азоте, а затем хранили при –70°С.
Коронарный срез мозга крысы через 3 часа после окклюзии левой средней мозговой артерии на уровне брегмы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Электрофоретическое разделение РНК
Материалы: для приготовления 1,5% агарозного геля требуется 1,5 г агарозы на 100 мл 1х ТАЕ (трис-ацетатного буфера).
Для приготовления 100 мл трис-ацетатного буфера (50х ТАЕ): 24,22 г триса (трис(гидроксиметил)аминометана (HOCH2)3CNH2 ), 1,862 г ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты), 8,96 мл ледяной уксусной кислоты и 73,3 г деионизированной воды.
|
|
|
Для приготовления денатурирующего буфера для нанесения РНК: 50% деионизированный формамид, 6% формальдегид, 1х ТАЕ, 0,03% краситель бромфеноловый синий.
Важным условием для получения адекватных данных при оценке количества мРНК в биологических образцах является качество полученных из них препаратов суммарной РНК [142].
Для подтверждения нативности полученных нами препаратов суммарной РНК проводили их электрофоретическое фракционирование в агарозном геле в денатурирующих условиях (Рис. 6). Осадок РНК (1 – 2.5 мкг) растворяли в денатурирующем буфере для нанесения РНК. Фракционирование РНК проводили в горизонтальном 1.5% агарозном геле. Для приготовления геля необходимое количество агарозы растворяли с нагреванием в 1х ТАЕ. Образцы перед нанесением на гель прогревали при 65°С в течение 15 минут в термостате «Гном» (ДНК-технология, Россия), охлаждали во льду 5 минут и наносили на гель.
Рисунок 2.2. Электрофореграмма суммарной РНК лобно-теменной доли коры крыс в денатурирующем 1,5% агарозном геле. 28S, 18S, 5S – субъединицы рибосомной РНК. 1, 2, 3 – препараты РНК коры мозга крыс.
|
|
|
Электрофорез проводили в течение 30 минут в камере для горизонтального электрофореза (BioRad, США) при напряжении 120В, источник питания «Эльф-8» (ДНК-технология).
2.2.2. Синтез одноцепочечной кДНК
Препараты суммарной РНК использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием реактивов RevertAid First Strand cDNA Sinthesis (MBI Fermentas, Латвия) в реакционной смеси объёмом 20 мкл. Спиртовую смесь, содержащую 5 мкг РНК, в течение 15 минут центрифугировали при 10000 оборотов в минуту, затем промывали 75% этанолом (100 мкл) и центрифугировали 5 минут в том же режиме. Остаток высушивали в концентраторе и растворяли в 12 мкл деионизированной воды, добавляли 1 мкл праймера олиго(dT)18 и в течение 5 минут инкубировали при 70оС, а затем помещали в лёд. Далее добавляли 4 мкл 5х буфера для обратной транскрипции, 1 мкл (20 ед.) ингибитора РНКаз, 2 мкл 10мМ смеси трифосфатов и выдерживали 5 минут при 37оС. Затем в пробу добавляли 200 единиц ревертазы и инкубировали в течение часа при 42оС. Реакцию останавливали 10-минутной инкубацией при 70оС. Пробы одноцепочечной кДНК хранили при -20оС.
2.2.3. Подбор праймеров
Специфичные праймеры к референсным генам Gapdh, Lhda, Rpl3 и двум транскриптам были подобраны с помощью пакета программ OLIGO Primer Analysis Software 6.31 и синтезированы фирмой ЗАО «Евроген».
|
|
|
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в ПЦР.
| Праймер | Последовательность праймера | GeneBank acc. no. | Позиция нуклеотидов | Длина ПЦР-продукта |
| Gapdh (F) | 5’-TGCCATCAACGACCCCTTCA-3’ | NM_017008 | 117 - 136 | 188 п.н. |
| Gapdh (R) | 5’-ACTCAGCACCAGCATCACCC-3’ | 285 – 304 | ||
| Rpl3 (F) | 5’-ATGGGTCCTTGGGCTTCTTG-3’ | NM_1987532 | 58 - 77 | 2 39 п.н. |
| Rpl3 (R) | 5’-CACAATACCCACAACCACCA-3’ | 277 - 296 | ||
| Ldha (F) | 5’-GCGTCTCCCTGAAGTCTCTGA-3’ | NM_017025 | 726 - 746 | 232 п.н. |
| Ldha (R) | 5’-TCCTTGATTCCATAGAGACCCT-3’ | 936 - 957 | ||
| Cplx2_v1 (F) | 5’-GGAGGAGTGAGGAGGACGGG-3’ | U35099 | 24 - 43 | 132 п.н. |
| Cplx2_v1 (R) | 5’-CACCAAGCAGGGTAGATAGCAT-3’ | 134 - 155 | ||
| Cplx2_v2 (F) | 5’-CTGGCTGAGGGGCGTGATT-3’ | NM_ 053878 | 25 - 43 | 172 п.н. |
| Cplx2_v2 (R) | 5’-CAGCAACCGTCTAAGCCACTG-3’ | 176 - 196 |
2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-time PCR)
Реакционная смесь для ПЦР объёмом 25 мкл содержала 0,02 мкл пробы реакции обратной транскрипции, по 5 пкмоль прямого и обратного праймеров, 5x реакционной смеси («Евроген»), включающей буфер, Taq ДНК-полимеразу, набор дНТФ и интеркалирующий краситель SYBR Green I. Амплификация кДНК в присутствии праймеров к генам Cplx2 и ряда генов домашнего хозяйства (housekeeping genes), используемых в качестве референсных - Rpl3 (ген одного из рибосомальных белков), Gapdh (ген глицеральдегидфосфатдегидрогеназы), Ldha (ген лактатдегидрогеназы) - проводилась на приборе Step One Plus (Applied Biosystems).
Каждый образец кДНК анализировался трижды. На графиках зависимости уровня флуоресценции от температуры плавления продуктов амплификации для каждой пары праймеров обнаружен один максимум, соответствующий температуре плавления продукта ПЦР.
Амплификация проводилась в следующем режиме: нагревание до 95оС (10 минут), далее шло 40 циклов следующего состава: денатурация при 95оС - 10 секунд, отжиг праймера при 65оС в течение 15 секунд, элонгация цепи при 72оС - 20 секунд.
Работы по подготовке ПЦР (приготовление растворов, дозирование кДНК и реакционных смесей) проводились в ламинарном боксе. Носики для автоматических пипеток, вода и пипетки предварительно выдерживались под УФ-излучением в течение 15 минут.
2.2.5. Анализ уровня экспрессии генов методом ОТ-ПЦР
Сравнение уровня мРНК исследуемого гена и референсных генов в коре и подкорковых структурах крыс в условиях экспериментальной ишемии проводили с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени [143], [144], [145]. Определение относительного уровня мРНК исследуемого гена проводилось с помощью программы REST (Relative Expression Software Tool) [146], позволяющей сравнивать относительный уровень экспрессии гена в контрольной и опытной группах с учётом нормализации к контрольному гену и поправкой на эффективность ПЦР. В качестве контрольных генов использовали ген Gapdh (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, один из ферментов гликолиза), ген Rpl3 (этот ген кодирует белок L3, который входит в состав 60S субъединицы рибосомы.) и Ldha (ген кодирующий лактатдегидрогеназу). По отношению к мРНК этих генов нормировалось содержание исследуемых транскриптов. Гены Gapdh, Rpl3 и Ldha, будучи генами «домашнего хозяйства», характеризуются достаточно постоянным уровнем экспрессии в тканях мозга в том числе и в условиях экспериментальной ишемии, поэтому они могут быть использованы в количественных исследованиях мРНК в нервной ткани как референсные гены. В то же время использование нескольких референсных генов в количественном анализе ОТ-ПЦР позволяет проводить более точный анализ содержания транскриптов.
Математическая модель программы REST вычисляет относительный уровень экспрессии (R) исследуемого гена. Особенности работы модели состоят в следующем: рост сигнала флуоресценции связан с увеличением количества циклов ПЦР и прямо пропорционален накоплению продуктов амплификации:
Cn = C0 (E)n = k rn =k r0(E)n ,
где Cn – концентрация после цикла n, С0 – исходная концентрация кДНК, Е – эффективность амплификации, r0 и rn – соответствующие измерения флуоресценции, k – постоянная величина.
Прибор регистрирует номер цикла Сt, при котором уровень флуоресценции значительно отличается от фонового. Эта величина измеряется для всех образцов. Уровень экспрессии (R) гена вычисляется по следующей формуле:
R = C0 sample/ C0 cont = E(Ct cont – Ct sample)
Уровень экспрессии исследуемого гена относительно контрольного:
Rrel.= Rtarget / Rreference ,
где Rtarget – уровень экспрессии исследуемого гена,
Rreference – уровень экспрессии референсного гена.
Итоговое выражение для вычисления относительного уровня экспрессии опытного гена (Rrel) имеет вид:
Rrel. = Etarget(Ct cont –Ct sample)/Eref(Ct cont –Ct sample) ,
где Etarget – эффективность ПЦР для исследуемого гена,
Eref – эффективность ПЦР для контрольного гена,
Ct cont – уровень экспрессии гена контрольной группы,
Ct sample – уровень экспрессии того же гена опытной группы.
Эффективность ПЦР определяется методом серии разведений одного из образцов и вычисляется по формуле для каждого гена и каждой структуры мозга:
E = 10(-1/slope)
где slope – это наклон калибровочной прямой, отображающей зависимость Ct от концентрации кДНК.
Стандартная ошибка для значения эффективности рассчитывается следующим образом:
SE(E)= [(Е ln10) / slope2] s.e.(slope)
где SE(E) – стандартная ошибка (standard error) значения эффективности,
SE(slope) – стандартная ошибка наклона прямой.
Матрицей для ПЦР служила одноцепочечная кДНК, полученная с помощью обратной транскрипции мРНК, выделенных из тканей головного мозга крыс. Амплификация продуктов гена-мишени и гена-референса проводилась в разных пробирках при оптимальных условиях для каждого гена.
Для определения эффективности амплификации кДНК в тканях головного мозга крыс в присутствии каждой пары праймеров исследуемых генов проводили ПЦР серии разведений кДНК образцов для каждой исследуемой ткани. Используя данные пороговой флуоресценции Сt для разных количеств кДНК, рассчитывали эффективность амплификации для каждой пары праймеров, значения которой затем использовали для определения относительного уровня экспрессии исследуемых генов.
Статистическую обработку полученных данных экспрессии мРНК контрольного и исследуемых генов проводили в программе REST, позволяющей определять достоверность различий между группами с помощью статистического теста «Pair Wise Fixed Reallocation Randomisation Test».
Нулевой гипотезой данного теста является предположение, что различия в относительных уровнях мРНК между опытными и контрольными группами отсутствуют. Данный тест неоднократно и случайно перераспределяет наблюдаемые значения Сt для опытных и контрольных животных и каждый раз отмечает влияние эффекта перестановки на разницу среднего значения Сt между опытными и референсными группами. Доля таких эффектов, где разница больше, чем реально наблюдаемая в эксперименте, относительно всех распределений дает значение «критерия рандомизации» – р. Статистически значимыми считаются различия со значением р ≤ 0,05.
Глава 3. Результаты
3.1. Влияние ишемии на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс
Сначала исследовалось влияние фокальной ишемии на экспрессию транскриптов гена Cplx2 в лобной коре (повреждённый ишемией участок) и подкорке (часть мозга, которая находится под повреждённым участком коры) животных. Результаты анализа представлены в таблицах 2 и 3. Контрольными в данном случае считались данные ложнооперированных животных. В качестве препарата обе группы получали физраствор.
Анализ полученных данных показал следующее: через 3 часа количество обоих транскриптов как в коре, так и в подкорке, по сравнению с контрольной группой было незначительно сниженным. Через 24 часа фиксировалось довольно значительное снижение содержания обоих транскриптов (более чем в 2 раза) по сравнению с контрольной группой в коре головного мозга ишемизированных животных, что является статистически значимым результатом. В подкорке же снижение оставалось незначительным (в 0,7 раз) по сравнению с контрольной группой. Через 72 часа после окклюзии количество транскриптов Cplx2 в коре было выше в 2,3 – 2,6 раз по сравнению с контрольной группой. Однако значительное варьирование результатов в группе ложнооперированных крыс через 72 часа не позволяет считать различие между этими группами статистически достоверными. При этом серьёзных изменений экспрессии транскриптов Cplx2 в подкорке не было обнаружено (0,9 от уровня у ложнооперированных животных). Иначе говоря, исследование показало, что колебания уровня экспрессии гена Cplx2 (в двух вариантах транскриптов) при ишемии выражены в лобной коре головного мозга крыс и слабо выражены в подкорковых структурах. Что, по-видимому, отражает степень повреждения этих областей. Кроме того, важно отметить: исследуемый в данном случае фактор (ишемия) одинаково влияет на характер изменений экспрессии обоих транскриптов: уровень экспрессии снижался и повышался почти в одинаковое количество раз по сравнению с контрольными особями, хотя абсолютное количество двух разных транскриптов в зонах головного мозга различалось.
Таблица 2. Динамика изменений относительного содержания транскриптов гена Cplx2 (2 варианта транскриптов данного гена) в лобных долях головного мозга крыс, подвергнутых фокальной ишемии, получавших физраствор.
Числовое значение показывает, во сколько раз отличается уровень транскриптов гена у ишемизированных животных, получавших физраствор, от уровня мРНК этого гена у ложнооперированных животных. Жирным шрифтом выделены статистически значимые результаты. Данные представлены в виде R + SE , * – p < 0.05.
| Кора | 3ч | 24ч | 72ч |
| Ишемия | |||
| Cplx2_v1 | 0.8 ± 0.10 | 0.5 ± 0.12* | 2.3 ± 1.36 |
| Cplx2_v2 | 0.9 ± 0.14 | 0.5 ± 0.11* | 2.6 ± 1.56 |
Таблица 3. Динамика изменений относительного содержания транскриптов гена Cplx2 в подкорковых областях головного мозга крыс, подвергнутых фокальной ишемии, получавших физраствор. Числовое значение показывает, во сколько раз отличается уровень транскриптов гена у ишемизированных животных, получавших физраствор, от уровня мРНК этого гена у ложнооперированных животных. Данные представлены в виде R + SE .
| Подкорка | 3ч | 24ч | 72ч |
| Ишемия | |||
| Cplx2_v1 | 0.7 ± 0.28 | 0.7 ± 0.15 | 0.9 ± 0.19 |
| Cplx2_v2 | 0.7 ± 0.27 | 0.7 ± 0.13 | 0.9 ± 0.23 |
3.2. Влияние семакса на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс
Исследование влияния семакса проводились в структурах лобных долей (левая сторона) и в подкорке отдельно для каждого из двух транскриптов гена Cplx2. В таблицах 4 и 5 представлены результаты анализа экспрессии двух типов мРНК гена Cplx2 в мозге ишемизированных крыс, получавших семакс, в разное время после окклюзии сонных артерий: через 3 часа, через 24 часа и через 72 часа. В качестве контроля использовались данные, полученные от ишемизированных животных, которым вводился физраствор.
При этом статистически значимые результаты в лобной коре не были получены. Можно отметить лишь незначительное снижение экспрессии по сравнению с контрольным вариантом. В наибольшей степени по сравнению с остальными группами снижение уровня экспрессии отмечается через 72 часа после окклюзии сонных артерий (отношение уровня экспрессии гена у исследуемой группы к таковому у контрольной группы – 0,6). В подкорке значимого влияния семакса на экспрессию транскриптов Cplx2 не обнаружено. Наблюдается небольшое повышение количества транскриптов гена (в 1,3 раз) у 24-часовой группы, далее уровень экспрессии вновь снижается, почти сравниваясь с таковым у контрольной группы. При этом снова обнаруживается одинаковое влияние фактора (в данном случае семакса) на содержание обоих транскриптов гена Cplx2.
Таблица 4. Динамика изменений относительного содержания транскриптов гена Cplx2 в лобных долях коры головного мозга крыс, подвергнутых фокальной ишемии, получавших семакс и PGP. Числовое значение показывает, во сколько раз отличается уровень транскриптов гена у животных, получавших семакс или PGP, от уровня мРНК этого гена у ишемизированных животных, получавших физраствор. Данные представлены в виде R + SE , * – p < 0.05. Статистически значимые результаты дополнительно выделены жирным шрифтом.
| Кора | 3ч | 24ч | 72ч |
| Семакс | |||
| Cplx2_v1 | 0.9 ± 0.20 | 0.8 ± 0.36 | 0.6 ± 0.37 |
| Cplx2_v2 | 0.9 ± 0.21 | 0.8 ± 0.28 | 0.6 ± 0.38 |
| PGP | |||
| Cplx2_v1 | 1.0 ± 0.15 | 0.7 ± 0.25 | 0.2 ± 0.12* |
| Cplx2_v2 | 1.1 ± 0.16 | 0.6 ± 0.20 | 0.2 ± 0.12* |
Таблица 5. Динамика изменений относительного содержания транскриптов гена Cplx2 в подкорке крыс, подвергнутых фокальной ишемии, получавших семакс и PGP. Числовое значение показывает, во сколько раз отличается уровень транскриптов гена у животных, получавших семакс или PGP, от уровня мРНК этого гена у ишемизированных животных, получавших физраствор. Данные представлены в виде R + SE .
| Подкорка | 3 ч | 24 ч | 72 ч |
| Семакс | |||
| С plx2_v1 | 1.0 ± 0.47 | 1.3 ± 0.3 | 1.1 ± 0.18 |
| Cplx2_v2 | 1.0 ± 0.43 | 1.3 ± 0.29 | 0.9 ± 0.24 |
| PGP | |||
| Cplx2_v1 | 1.7 ± 0.62 | 1.4 ± 0.38 | 1.1 ± 0.25 |
| Cplx 2_ v 2 | 1.7 ± 0.58 | 1.3 ± 0.38 | 1.3 ± 0.34 |
3.3. Влияние PGP на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс
Исследование влияния семакса проводились в структурах лобных долей (левая сторона) и в подкорке отдельно для каждого из двух транскриптов гена Cplx2. В таблицах 5 и 6 представлены результаты анализа экспрессии двух вариантов мРНК гена Cplx2 в мозге ишемизированных крыс, получавших PGP, в разное время после окклюзии сонных артерий: через 3, 24 и 72 часа. В качестве контроля использовались данные, полученные от ишемизированных животных, которым вводился физраствор.
При анализе результатов в коре отмечено постепенное снижение уровня содержания транскриптов гена Cplx2: через 3 часа каких-либо существенных изменений по сравнению с контрольным вариантом не обнаруживалось, но через сутки отношение количества мРНК гена Cplx2 у животных, получавших PGP, к таковому у ишемизированных животных, получавших физраствор, составляло 0,6 – 0,7. Через трое суток аналогичное соотношение составляло 0,2, что является статистически значимым результатом. При этом, как и в рассмотренных выше случаях, препарат одинаково влияет на характер изменений экспрессии изученных транскриптов: количество транскриптов Cplx 2_ v 1 и Cplx 2_ v 2 уменьшается примерно в одинаковое количество раз, хотя абсолютное количество транскриптов неодинаково.
В подкорковой области, напротив, количество транскриптов гена Cplx2 в условиях введения PGP увеличивается по сравнению с контрольной группой (и вновь относительное содержание обоих транскриптов изменяется приблизительно одинаково): через 3 часа после операции уровень содержания транскриптов гена Cplx2 у ишемизированных крыс, получавших PGP, составлял 1,7 относительно уровня содержания этих транскриптов у контрольных животных, через 24 часа – 1,4 и 1,3, а через 72 часа – 1,1 и 1,3 (для транскриптов Cplx 2_ v 1 и Cplx 2_ v 2 соответственно).
Если учесть, что при ишемии в коре головного мозга через 24 часа отмечалось значительное снижение, а через 72 часа – значительное повышение содержания транскриптов гена Cplx2 по сравнению с ложнооперированными животными, то влияние семакса и PGP, которые у исследуемых групп сначала очень незначительно снижают уровень экспрессии гена Cplx2, а затем снижают его более резко по сравнению с уровнем экспрессии того же гена у ишемизированных животных, получавших физраствор (у них как раз содержание транскриптов гена по сравнению с нормой увеличивается), то влияние препаратов можно считать нормализующим.
В подкорке колебания уровня экспрессии гена не столь выражены как под влиянием ишемии, так и под влиянием препаратов. Однако и здесь прослеживается нормализующий эффект препаратов: если при ишемии в подкорке содержание транскриптов гена Cplx2 незначительно снижалось по сравнению с ложнооперированной группой, то при введении семакса и PGP оно несколько повышается по сравнению с группой животных с ишемией, получавших физраствор.
Глава 4. Обсуждение результатов
Церебральная ишемия является серьёзным повреждающим фактором, воздействующим на головной мозг. В тканях мозга немедленно нарушается нормальное протекание клеточных реакций из-за недостатка притока кислорода и глюкозы. Изменения на молекулярном и клеточном уровнях, такие как модификация клеточных рецепторов в результате реакций глутамат-кальциевого каскада, являются сигналом к экспрессии генов, обеспечивающих синтез веществ, которые участвуют как в деструктивных, так и в репарационных процессах. Эти сигналы передаются к ядру клетки при помощи вторичных мессенджеров. Анализ экспрессии генов в условиях экспериментальной церебральной ишемии помогает, с одной стороны, оценить, как работает генетический аппарат в условиях нарушения нормального протекания внутриклеточных процессов, а с другой стороны, выяснить, какую роль играет генетический аппарат в процессах деструкции и репарации. Изучение экспрессии генов при введении нейропротекторных препаратов ишемизированным животным позволяет исследовать реакцию генома животных на действие препаратов и оценивать их эффективность.
Для исследования процессов, происходящих в ишемизированной нервной ткани, используются экспериментальные модели ишемии. Существует несколько моделей экспериментальной ишемии мозга. Фокальная ишемия возникает при окклюзии отдельных сосудов мозга крысы (классический модельный объект для подобных исследований) и приводит к локальным нарушениям в определённых участках мозга. Глобальная церебральная ишемия вызывается окклюзией двух общих сонных и двух позвоночных артерий и приводит к обширным, тяжёлым и необратимым изменениям в головном мозге.
Нами была использована экспериментальная модель фокальной ишемии мозга крыс, поскольку окклюзия левой средней мозговой артерии более точно воспроизводит патологические процессы при инсульте [141]. Область ишемического повреждения в этом случае находилась в лобном участке коры (левая сторона). Для оценки влияния ишемии на экспрессию гена Cplx2 в качестве контроля использовались ложнооперированные животные. Это было сделано с целью исключения влияния оперативного вмешательства (повреждение тканей, наркоз, введение препаратов) на экспрессию.
Анализ относительного уровня содержания транскриптов гена Cplx2 проводился через 3 часа, 24 часа и 72 часа. По литературным данным [147], [148], уже через 3 часа после окклюзии в зоне ишемического повреждения появляются участки различной степени поражения. Клетки зоны повреждения находятся в состоянии ишемического шока: можно наблюдать характерное сморщивание нейронов и уплотнение ядер. Кроме того обнаруживаются первые признаки отёка. В это время включаются в работу гены раннего реагирования, к которым, вероятно, не относится Cplx 2, о чём свидетельствует отсутствие значительных изменений содержания мРНК как в коре, так и в подкорке. Через 24 часа после операции (время максимального ответа) ядро ишемии окружено пенумброй, в области ядра наблюдаются некроз клеток, вакуолизация и отёк нейропиля (область локализации отростков нервных клеток), иначе говоря, вследствие ухудшения кровотока начинаются и прогрессируют серьёзные изменения на клеточном и тканевом уровнях. Через 72 часа в условиях данной модели в повреждённых тканях наблюдаются репарационные процессы.
Поскольку в развитии ишемического повреждения весьма существенную роль играет глутаматная эксайтотоксичность, обусловленная, в частности, избыточным высвобождением глутамата в составе синаптических пузырьков, а в процессе экзоцитоза непосредственное участие принимают комплексины, можно использовать анализ экспрессии гена Cplx2 в качестве одной из характеристик повреждающего воздействия ишемии на головной мозг, и эффективности лекарственной терапии.
При анализе результатов эксперимента было обнаружено, что через 24 часа после операции количество транскриптов гена в коре ишемизированных крыс резко снижалось: по отношению к контрольной группе (ложнооперированные животные) оно составляло менее чем 0,5 для обоих вариантов транскриптов, что является статистически значимым результатом. Через 72 часа аналогичное соотношение составляло 2,3 – 2,6, что свидетельствует о значительном повышении количества соответствующей мРНК по сравнению с контрольной группой. В подкорке колебания уровня мРНК гена Cplx 2 по сравнению с контрольной группой были незначительными для обоих транскриптов, что, по-видимому, связано с тем, что подкорковая область в значительно меньшей степени поражена ишемией (областью поражения в данном эксперименте является левая лобная доля коры).
Семакс в коре головного мозга во всех трёх временных точках незначительно понижал уровень содержания транскриптов гена Cplx2 для обоих транскриптов, но для 3 и 24 часов это понижение не может считаться достоверным. Через 72 часа количество обоих транскриптов в коре у ишемизированных животных, которым вводился семакс, по отношению к контролькой группе (ишемизированные животные, которым вводился физраствор) составляло 0.6, что говорит о том, что препарат, вероятно, может в некоторой степени отсроченно смещать уровень экспрессии гена в коре головного мозга в сторону нормализации (учитывая повышение содержания транскриптов в 2.3 – 2.6 раз в коре ишемизированных животных по сравнению с ложнооперированными). Влияние семакса на экспрессию гена Cplx2 в подкорке оказалось ещё менее выраженным, чем в коре, что также согласуется с локализацией зоны ишемии.
PGP в целом понижает уровень мРНК гена Cplx2 в коре головного мозга ишемизированных крыс. Через 72 часа отношение содержания мРНК у ишемизированных крыс, которым вводился PGP, к содержанию мРНК у контрольной группы (крыс с ишемией, которым вводился физраствор) составляет 0.2, что является статистически значимым результатом. В подкорке PGP, напротив, несколько повышает содержание транскриптов гена Cplx 2, особенно через 3 часа, когда отношение содержания транскриптов гена у исследуемой группы к содержанию транскриптов у контрольной группы составляет 1.7. В других временных точках это отношение уменьшается, через 72 часа оно минимально (1.1 – 1.3).
Следует подчеркнуть, что корреляция между количеством мРНК в клетке в какой-либо момент и уровнем экспрессии белка не всегда является прямой. Более низкий уровень содержания мРНК по сравнению с контролем может свидетельствовать как о снижении синтеза мРНК этого гена, так и о более значительной деградации мРНК, например, связанной с высокой скоростью трансляции и последующими процессами посттрансляционной деградации мРНК. В совокупности с неоднозначностью функций комплексинов делать глобальные и однозначные выводы о влиянии ишемии и препаратов на его экспрессию, ограничившись всего лишь сопоставлением уровня мРНК гена Cplx 2 у исследуемой группы, с уровнем мРНК того же гена у контрольной группы, вряд ли корректно. Для этого необходимо знать не только колебания уровней мРНК, но и динамику изменений содержания белка. Также ещё предстоит узнать скорость оборота (turnover) как мРНК, так и белка CPLX2. Эти данные помогут правильно интерпретировать полученные результаты.
Эффектом применения препаратов может являться некоторое усиление экзоцитоза у клеток нервной ткани, которое сопровождается снижением мРНК гена Cplx 2. Причём это может быть выброс как нейротрансмиттеров (не обязательно возбуждающих), так и других активных молекул, например, факторов роста. Положительное влияние семакса и PGP на экспрессию генов нейротрофинов подтверждено рядом исследований [149], [150]. В любом случае на отметке 72ч под влиянием препаратов очевидно смещение количества транскриптов гена Cplx 2 в сторону сближения с контрольной группой. Особенно это заметно в коре и сильнее выражено при действии PGP, нежели семакса.
Как уже говорилось выше, ишемия, семакс и PGP одинаково влияют на характер изменений экспрессии обоих изученных транскриптов гена Cplx 2. В нашем эксперименте оба альтернативных варианта ведут себя одинаково, таким образом, ишемия не влияет на предпочтительный выбор экспрессии того или иного транскрипта. Опираясь на полученные результаты, можно сделать предположение, позволяющее объяснить схожее поведение альтернативных транскриптов при существующем у них различии в абсолютном количестве. Клетка продуцент синтезирует оба транскрипта, в определенном соотношении. Например, на две молекулы Cplx 2_ v 1 всегда приходится приблизительно одна молекулы Cplx 2_ v 2. При этом любые изменения в экспрессии Cplx 2 одинаково затрагивают оба варианта, с сохранением соотношения.
Так или иначе, одинаковый профиль экспрессии обоих транскриптов в рамках эксперимента указывает на их значительное функциональное сходство. В настоящее время неизвестно, какова функциональная значимость двух вариантов транскриптов гена Cplx 2. Можно лишь предположить, что как в некоторых известных случаях, такой механизм регуляции экспрессии генов может быть использован, прежде всего, для временного и пространственного контроля над синтезом белка.
Эффекты семакса и PGP при схожей направленности количественно существенно отличаются. В целом влияние PGP на экспрессию гена Cplx 2 выражено сильнее, чем влияние семакса. Однако поскольку семакс деградирует с образованием PGP (в том числе и его метаболитов), эффекты семакса могут быть обусловлены эффектами концевого трипептида PGP.
Выводы
1. Подготовлена панель образцов кДНК для анализа экспрессии генов в условиях экспериментальной ишемии головного мозга крыс и воздействия пептидов семакс и PGP.
2. Под воздействием ишемии относительное содержание транскриптов гена Cplx 2 в коре головного мозга спустя сутки после окклюзии снижается в 2 раза. При этом влияния ишемии на содержание мРНК гена Cplx 2 в подкорковых структурах не обнаружено.
3. В условиях фокальной ишемии оба исследуемых пептида вызывают снижение содержания мРНК гена Cplx 2 в коре головного мозга крысспустя 72 часа после окклюзии. Эффект PGP оказывается более выраженным, чем эффект семакса. Влияния препаратов в подкорке не наблюдается.
4. Не обнаружено различий в характере изменений экспрессии альтернативных транскриптов гена Cplx 2 в условиях эксперимента.
Список литературы
1. Walsh G., Jefferis R. 2006. Post-translational modifications in the context of therapeutic proteins // Nat Biotechnol 24: 1241—1252.
2. Jensen O.N. 2006. Interpreting the protein language using proteomics // Nat Rev Mol Cell Biol 7: 391—403.
3. Ernst J., Kellis M. 2010. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome // Nat Biotechnol. 28(8):817-25.
4. Zhou V.W., Goren A., Bernstein B.E. 2011. Charting histone modifications and the functional organization of mammalian genomes // Nat Rev Genet. 12(1):7-18.
5. Guelen L., Pagie L., Brasset E., Meuleman W., Faza M.B., Talhout W., Eussen B.H., de Klein A., Wessels L., de Laat W., van Steensel B. 2008. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions // Nature. 453(7197):948-51.
6. Ryba T., Hiratani I., Lu J., Itoh M., Kulik M., Zhang J., Schulz T.C., Robins A.J., Dalton S., Gilbert D.M. 2010. Evolutionarily conserved replication timing profiles predict long-range chromatin interactions and distinguish closely related cell types // Genome Res. 20(6):761-70.
7. Прошкина Г.М, Шпаковский Г.В. 2003. Структура и функции транскрипционного аппарата эукариотической РНК-полимеразы III //
Успехи биологической химии, т. 43, с. 139—162
8. Патрушев Л.И., Минкевич И.Г. Проблема размера геномов эукариот. – Успехи биологической химии, т. 47, 2007, с. 293–370.
9. http://humbio.ru/humbio/transcription/0003381d.htm
10. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. – М.: Наука, 2000. Глава 1, с. 25 – 58.
11. Guo H., Ingolia N.T., Weissman J.S., Bartel D.P. 2010. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels // Nature. 466(7308):835-40.
12. Khraiwesh B., Arif M.A., Seumel G.I., Ossowski S., Weigel D., Reski R., Frank W. 2010. Transcriptional control of gene expression by microRNAs // Cell. 140(1):111-22.
13. Bartel D.P. 2009. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions// Cell. 136(2):215-33.
14. Voinnet O. 2009. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs // Cell. 136(4):669-87.
15. Krol J., Loedige I., Filipowicz W. 2010. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay // Nat Rev Genet. (9):597-610.
16. Carthew R.W., Sontheimer E.J. 2009. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs// Cell.136(4):642-55.
17. Wu L., Belasco J.G. 2008. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs // Mol Cell. 29(1):1-7.
18. Eulalio A., Huntzinger E., Izaurralde E. 2008. Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing // Cell.132(1):9-14.
19. Filipowicz W., Bhattacharyya S.N., Sonenberg N. 2008. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? // Nat Rev Genet. (2):102-14.
20. Huntzinger E., Izaurralde E. 2011. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay // Nat Rev Genet. 12(2):99-110.
21. Martin K.C., Kosik K.S. 2002. Synaptic tagging- who's it? // Nat Rev Neurosci. (10):813-20.
22. Raj A., van Oudenaarden A. 2008. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences // Cell. 135(2):216-26.
23. Lehner B. 2010. Conflict between noise and plasticity in yeast // PLoS Genet. 6(11):e1001185.
24. Raser J.M., O'Shea E.K. 2005. Noise in gene expression: origins, consequences, and control // Science. 309(5743):2010-3.
25. Blake W.J., Balázsi G., Kohanski M.A., Isaacs F.J., Murphy K.F., Kuang Y., Cantor C.R., Walt D.R., Collins J.J. 2006. Phenotypic consequences of promoter-mediated transcriptional noise// Mol Cell. 24(6):853-65.
26. Huh D., Paulsson J. 2011. Non-genetic heterogeneity from stochastic partitioning at cell division // Nat Genet. 43(2):95-100.
27. Maier T., Güell M., Serrano L. 2009. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples // FEBS Lett. 583(24):3966-73.
28. de Sousa Abreu R., Penalva L.O., Marcotte E.M., Vogel C. 2009. Global signatures of protein and mRNA expression levels // Mol Biosyst.(12):1512-26.
29. Schwanhäusser B., Busse D., Li N., Dittmar G., Schuchhardt J., Wolf J., Chen W., Selbach M. 2011. Global quantification of mammalian gene expression control // Nature. 473(7347):337-42.
30. Greenbaum D., Colangelo C., Williams K., Gerstein M. 2003. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale // Genome Biol. 4(9):117.
31. Jacewicz M., Kiessling ., Pulsinelli W.A. J Cereb Blood Flow Metab 1986; 6: 263 – 272.
32. Гусев Е.И., Скворцова В.И., «Ишемия головного мозга», Москва, «Медицина» 2001, Глава 1: стр. 18 – 23.
33. Fisher M., Takano K. In: Ballierie’s clinical neurology, cerebrovascular disease (Hachinski V. ed.), London 1995; 279 – 296.
34. Astrup J., Siesji B.K., Symon L. Stroke 1981; 12: 723 – 725.
35. Symon L., Bronston N.M., Strong A.J. et al. J Clin Pathol 1977; 30: 149 – 154.
36. Ginsberg M.D., Pulsinelli W.A. Ann Neurol 1994; 36: 553 – 554.
37. Heiss W.D., Rosner G. Ann Neurol 1983; 14; 294 – 301.
38. Kirino T., Sano K. Acta Neuropathol 1984; 62: 209 – 218.
39. Kirino T., Tamura A., Sano K. Acta Neuropathol 1984; 64: 139 – 147.
40. Pulsinelli W.A., Brierley J., Plum F. Ann Neurol 1982; 491 – 498.
41. Butcher S.P., Bullock R., Graham D.I. et al. Stroke 1990; 21: 1727 – 1733.
42. Heiss W.D., Graf R. Curr Opin Neurobiol 1994; 1: 11 – 19.
43. Ozyurt E. J Cereb Blood Flow Metab 1988; 8: 138 – 143.
44. Dirnagl U., Iadecola C., Moskowitz M. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view // Trends Neurosci. — 1999. — № 22. — С. 391-397.
45. Квитницкий-Рыжов Ю.Н. Современное учение об отёке и набухании головного мозга. — К.:: Здоров’я, 1988.
46. Мчедлишвили Г.И. Отёк головного мозга. — Тбилиси: «Мецниереба», 1986.
47. Черний В.И., Кардаш А.М., Городник Г.А., Дроботько В.Г. Диагностика и лечение отёка и набухания головного мозга. — К.:: Здоров’я, 1997. — С. 228.
48. Kuroda S., Siesjö B.K. Reperfusion damage following focal ischemia: pathophysiology and therapeutic windows // Clin Neurosci. — 1997. — № 4. — С. 199-212.
49. Planas A.M., Gorina R., Chamorro A. Signalling pathways mediating inflammatory responses in brain ischaemia // Biochem Soc Trans. — 2006. — № 34. — С. 1267-1270.
50. Евзельман М.А. Ишемический инсульт. Орёл, 2003.
51. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. 2001.
52. Garcia J.H., Yoshida Y., Chen H. et al. Am J Pathol 1993; 142: 623 – 635.
Клигуненко Е.Н., Дзяк Л.А., Площенко Ю.А., Емельянова Е.А., Зозуля О.А. Нейропротекция в анестезиологии и интенсивной терапии // Международный неврологический журнал, 2008, 2 (18).
54. Chen H., Chopp M., Chultz L. et al. J Neurol Sci 1993; 118: 106 – 109.
55. Clark R.K., Lee E.V., Fish C.J. et al. Brain Res Bull 1993; 31: 565 – 572.
56. Graeber M.D., Streit W.J. Brain Pathol 1990; 1: 2 – 5.
57. Wood P.L. Life Sci 1994; 55(9): 666 – 668.
58. Giulian D. Reactive microglia and ischemic injury. In: Primer on Cerebrovascular Dis eases (Welsh M., Caplan L., Siesjo В., Weir B. Reis D.J. eds.). San Diego, CA, Academic 1997; 117 – 124.
59. Banati R.B., Gehrmann S., Schubert P., Kreutzberg G.W. Glia 1993; 7: 111 – 118.
60. McGeer E.G., McGeer P.L. Neurodegeneration and the immune system. In: Neurodegenerative Diseases (Calne D.B. ed.). Philadelphia, Saunders, Harcourt, Brace & World 1994; 277 – 299.
61. McGeer P.L., Kawamala Т., Walker D.G. et al. Glia 1993; 7: 84 – 92.
62. Giulian D., Corpuz M., Chapman S. et al. J Neurosci Res 1993; 36: 681 – 693.
63. Morioka Т., Kalehua A.N., Streit W.J. J Comp Neurol 1993; 327: 123 – 132.
64. Боголепов Н.Н., Бурд Г.С. Материалы VII Всесоюзного съезда невропатологов и психиатров. - М., 1981; 2: 32 – 35.
65. Бурд Г.С. Дыхательная недостаточность у больных с острыми нарушениями мозгового кровообращения: Дисс. д-ра мед. наук. - М., 1983.
66. Garcia J.H., Liu K.F., Ho K.L. Stroke 1995; 26: 636 – 642.
67. Charriaut-Marlangue C., Margaill I., Plotkine M., Ben-Ari Y. J Cereb Blood Flow Metab 1995; 15: 385 – 388.
68. Charriaut-Marlangue C., Margaill I., Represa A. J Cereb Blood Flow Metab 1996; 16: 186 – 194.
69. Li Y., Chopp M., Jiang N. et al. J Cereb Blood Flow Metab 1995; 15: 389 – 397.
70. Linnik M.D., Zobrist R.H., Hatfield M.D. Stroke 1993; 24: 2002 – 2008.
71. Sadoul R., Dubois-Dauphin M., Fernandel P.A. et al. Adv Neurol 1996; 71: 419 – 424.
72. Chopp M., Li Y. Acta Neurochir 1996; 66: 21 – 26.
73. Garcia J.H., Liu K.F., Yoshida Y. Et al. Am J Pathol 1994; 145: 728 – 740.
74. Zhang F., White J.G., Iadecola C. J Cereb Blood Flow Metab 1994; 14: 217 – 226.
75. Zhang R.L., Chopp M., Chen H. et al. J Neural Sci 1994; 125: 3 – 10.
76. http://humbio.ru/humbio/ishemia/00068913.htm
77. Iadecola C. Mechanisms of cerebral Ischemic damage. In: Cerebral Ischemia (Wolfgang Walz ed.). New Jersey, Totowa, Humana Press 1999; 3 – 33.
78. Krupinski J., Kaluza J., Kumar P. et al. Lancet 1993; 342: 742.
79. Krupinski J., Kaluza J., Kumar P. et al. .KrupinskiJ., Kaluza J., Kumar P. et al. Stroke 1994; 25: 1794 – 1798.
80. Липская Л.А. Цитология 1994; 36 (3): 303 – 309.
81. Bennett M.R., Huxlin K.R. Gen Pharmacol 1996; 27: 407 – 419.
82. Morley P., Tauskela J.S., Hakim A.M. Cerebral Ischemia (Wolfgang Walz ed.). New Jersey, Totowa, Humana Press 1999; 69 – 105.
83. Nicotera P., Zhivotovsky B., Orrenius S. Cell Calcium 1994; 16: 279 – 288.
84. Siesjo B.-K. Eur Neurol 1986; 25 (1): 45 – 56.
85. Choi D.W. J Neurosci 1990; 10: 2493 – 2501.
86. Hansen A.J. Physiol Rev 1985; 65: 101 – 148.
87. Fujisawa F.F., Dawson D., Browne S.E. at al. Brain Res 1993; 629: 73 – 78.
88. Lazarewitcz J.W. Acta Neurobiol Exp (Warsz) 1996; 56 (1): 299 – 311.
89. Morley P., Hogan M.J., Hakim A.M. Brain Pathol 1994; 4: 37 – 47.
90. Schousboe A., Frandsen A., Wayl P. et al. Neurotoxicology 1994; 15: 477 – 481.
91. Carmell J., Curtis A.R., Kemp J.A. et al. Neurosci Lett 1993; 153: 107 – 110.
92. Littman L., Glati B.S., Robinson M.B. Neurochem 1993; 61: 586 – 593.
93. Schoepp D.D., Conn P.J. Trends Pharmacol Sci 1993; 14: 13 – 20.
94. Sheardown M.J., Suzdak P.D., Nordholm E. Eur J Pharmacol 1993; 236: 347 – 353.
95. Scheinberg P. Neurology 1991; 41: 1867 – 1873.
96. Mitani A., Yanase H., Sakai K. Et al. Brain Res 1993; 601: 103 – 110.
97. Siesjo B.-K., Bengrsson F. J Cereb Blood Flow Metab 1989; 9: 127 – 140.
98. Berridge M.J. Triangi 1985; 3 (4): 79 – 90.
99. Orrenius S., McCabe M.S., Nicotera P. Toxicol Lett 1992; 64: 357 – 364.
100. Abe K., Kogure K., Yamamoto H. et al. J Neurochem 1987; 48: 503 – 509.
101. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Журнал «Невропатология и психиатрия» 1996; 2: 111 – 114.
102. Суслина З.А. Ишемические нарушения мозгового кровообращения и система простаноидов (клинико-биохимические исследования): Дисс. д.м.н. – М., 1991; 331.
103. Packer L.L., Packer L., Prilipko Y., Cyirsten Y. Free radicals in the brain. Berlin 1992; 1 – 20.
104. Choi D.W. Proc nati Acad Sci USA 1993; 90: 9741.
105. Steng M., Greenberg M.E. 1990. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system // Neuron. 4: 477–85.
106. Koistinaho J., Hökfelt T. 1997. Altered gene expression in brain ischemia // Neuroreport. V.8(2):1–8.
107. Honkaniemi J., Sharp F.R. 1996. Global ischemia induces immediate-early genes encoding zinc finger transcription factors // J Cereb Blood Flow Metab. V.16(4):557–565.
108. Akins P.T., Liu P.H., Hsu C.Y. 1996. Immediate early gene expression in response to cerebral ischemia. Friend or foe?// Stroke. V.27(9) :1682–1687.
109. Kinouchi H., Sharp F.R., Chan P.H., Koistinaho J., Sagar S.M., Yoshimoto T. 1994. Induction of c-fos, junB, c-jun, and hsp70 mRNA in cortex, thalamus, basal ganglia, and hippocampus following middle cerebral artery occlusion // J Cereb Blood Flow Metab. V.14(5).
110. Bergeron M., Yu A.Y., Solway K.E., Semenza G.L., Sharp F.R. 1999. Induction of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and its target genes following focal ischaemiain rat brain// Eur J Neurosci. (12):4159-70.
111. Bergeron M., Gidday J.M., Yu A.Y., Semenza G.L, Ferriero D.M., Sharp F.R. 2000. Role of hypoxia-inducible factor-1 in hypoxia-induced ischemic tolerance in neonatal rat brain// Ann Neurol. 48(3):285-96.
112. Crosby M.E., Kulshreshtha R., Ivan M., Glazer P.M. 2009. MicroRNA regulation of DNA repair gene expression in hypoxic stress // Cancer Res. 69(3):1221-9. Erratum in: Cancer Res. 69(7):3240.
113. Xia X., Lemieux M.E., Li W., Carroll J.S., Brown M., Liu X.S., Kung A.L. 2009. Integrative analysis of HIF binding and transactivation reveals its role in maintaininghistone methylation homeostasis // Proc Natl Acad Sci USA. 106(11):4260-5.
114. Benjamin I.J., Horie S., Greenberg M.L., Alpern R.J., Williams R.S. 1992. Induction of stress proteins in cultured myogenic cells. Molecular signals for the activation of heat shock transcription factor during ischemia// The journal of clinical investigation. V.89(5):1685–1689.
115. Obrenovitch T.P. 2008. Molecular physiology of preconditioning-induced brain tolerance to ischemia // Physiol Rev. (1): 211-47.
116. Iadecola C., Zhang F., Xu X. 1995. Inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates cerebral ischemic damage // Am J Physiol. V.268(2): 286–292.
117. Iadecola C. 1999. Mechanisms of cerebral ischemic damage. in Cerebral ischemia by Walz W. // Humana Press Totowa, New Jersey.
118. Moskowitz M.A., Lo E.H., Iadecola C. 2010. The science of stroke: mechanisms in search of treatments // Neuron. 67(2):181-98. Erratum in: Neuron. 2010 Oct 6;68(1):161.
119. Pabst S., Hazzard J.W., Antonin W., Südhof T.C., Jahn R., Rizo J., Fasshauer D. 2000. Selective interaction of complexin with the neuronal SNARE complex. Determinationof the binding regions // J Biol Chem. Jun 275(26):19808–19818.
120. Südhof T.C, Rothman J.E. 2009. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins // Science. 323(5913): 474–477.
121. Ishizuka T., Saisu H., Odani S., Abe T. 1995. Synaphin: a protein associated with the docking/fusion complex in presynaptic terminals // Biochem Biophys Res Commun 213 (3): 1107–1114.
122. Weninger K.R. 2011. Complexin arrests a neighbor // Nat Struct Mol Biol. 18(8):861–863.
123. Jorquera R.A., Huntwork-Rodriguez S., Akbergenova Y., Cho R.W., Littleton J.T. 2012. Complexin controls spontaneous and evoked neurotransmitter release by regulating and timing and properties of synaptotagmin activity // Journal of Neuroscience 32 (50): 18234–18245.
124. Hobson R.J., Liu Q., Watanabe S., Jorgensen E.M. 2011. Complexin maintains vesicles in the primed state in C. Elegans // Current Biology; 21 (2): 106–113.
125. Maximov A., Tang J., Yang X., Pang Z.P., Sudhof T.C. 2009. Complexin controls the force transfer from SNARE complexes to membranes in fusion // Science; 323 (5913): 516–521.
126. Raevskaya N.M., Dergunova L.V., Vladychenskaya I.P., Stavchansky V.V., Oborina M.V., Poltaraus A.B., Limborska S.A. 2005. Structural organization of the human complexin 2 gene(CPLX2) and aspects of its functional activity // Gene. 359:127–137.
127. An S.J., Grabner C.P., Zenisek D. 2010. Real-time visualization of complexin during single exocytic events// Nat Neurosci. V.13(5):577–83.
128. Hazell A.S., Wang D. 2011. Identification of complexin II in astrocytes: a possible regulator of glutamate release in these cells // Biochem Biophys Res Commun. 404(1):228–32
129. Hazell A.S. 2007. Excitotoxic mechanisms in stroke: an update of concepts andtreatment strategies. // Neurochem Int. 50(7–8):941–53.
130. Farooqui A.A., Ong W.Y., Horrocks L.A. 2008. Neurochemical Aspects of Excitotoxicity // Springer, New York, NY, USA, p168.
131. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. - М.: Медицина, 2001. - 328 с.
132. Ashmarin I.P., Nezavibat'ko V.N., Levitskaya N.G., Kamensky A.A. 1995. Desing and investigation of ACTH(4-10) analog deprived of D-aminoacids and hydrophobic radicals// Neurosci. Res. Commun. V.16:105–112.
133. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Чуканова Е.И. Семакс в профилактике прогрессирования и развития обострений у больных с дисциркуляторной энцефалопатией//Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2005, № 2.
134. Ашмарин И.П., Незавибатьков Н.Н., Мясоедов Н.Ф., Каменский А.А. и др. Ноотропный аналог адренокортикотропина 4-10 — Семакс (15-летний опыт разработки и изучения) //Журнал высшей нервной деятельности. 1997, т.47, с.419-425.
135. Hershkowitz M., Zwiers H., Gispen W.H. The effect of ACTH on rat brain
Synaptic plasma membrane lipid fluidity. Biochem Biophys Acta. 1982 Nov. 22; 692 (3): 495 – 497.
136. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Nezavibatko V.N. Degradation of ACTH/MSH (4 – 10) and its synthetic analog semax by rat serum enzymes: an inhibitor study. Peptides. 1993. V. 14. №3. p. 491 – 495.
137. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ляпина Л.А., Самонина Г.Е. Регуляторная активность простейших пролинсодержащих пептидов PG, GP, PGP и GPGG и возможные источники их биосинтеза // Биохимия, 1998. т.63, вып.2, стр. 149 – 155.
138. Grivennikov I.A., Dolotov O.V., Gol'dina Iu.I. 1999. Peptide factors in processes of proliferation, differentiation, and extended viability of mammalian nervous system cells // Mol Biol (Mosk). V.33(1):120-126.
139. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Мясоедов Н.Ф. 2000. Изучение влияния семакса на Са2+-ответы нейтрофилов человека // Доклады академии наук. 374(3):401–403.
140. Bashkatova V.G., Koshelev V.B., Fadyukova O.E., Alexeev A.A., Vanin A.F., Rayevsky K.S., Ashmarin I.P., Armstrong D.M. 2001. Novel synthetic analogue of ACTH 4-10 (Semax) but not glycine prevents the enhanced nitric oxide generation in cerebral cortex of rats with incomplete global ischemia// Brain. Res. 894:145–149.
141. Povarova O.V., Garibova T.L., Kalenikova E.I., Galaeva I.P., Kraineva V.A., Medvedev O.S., Voronina T.A. Effect of phenyl-tert-butylnitrone, mexidol and nooglutil on the ischemic lesion zone and memory in rats following middle cerebral artery occlusion // Eksp Klin Farmakol. 2004. V. 67(1). P. 3 – 6.
142. Hugget J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations // Genes Immun. 2005. V. 6(4). P. 279 – 284.
143. Bustin S. Absolute quantification of mRNA using real-time-reverse-transcription polymerase chain reaction assays. Journal of molecular endocrinology. 2000 V.25. P. 169 – 193.
144. Bustin S., Nolan T. Pitfalls of quantitative Real-Time-Reverse-transcription polymerase chain reaction. Journal of biomolecular techniques. 2004 V. 15. P. 155 – 166.
145. Pffafl M.W. A new mathematical model for relative quantitation in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001. V.29. N.9 P. 2002 – 2007.
146. Pffafl M., Horgan G., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression result in real-time PCR. Nucleic Acids Research. 2002. V.30 N.9 P. 1 – 10.
147. Garcia J.H., Yoshida Y., Chen H., Li Y., Zhang Z.G., Lian J., Chen S., Chopp M. Progression from ishemic injury to infarct following middle cerebral arteryocclusion in the rat // Am J. Pathol. 1993. V. 142(2). P. 623 – 635.
148. Wishcamper C.A., Brooks D.M., Coffin J.D., Lurie D.I. Focal cerebral ischemia upregulates SHP-1 in reactive astrocytes in juvenile mic e// Brain Research. 2003. V. 974 P. 88 – 98.
149. Дмитриева В.Г., Дергунова Л.В., Поварова О.В., Скворцова В.И., Лимборская С.А., Мясоедов Н.Ф. 2008. Действие семакса и его С-концевого трипептида PGP на экспрессию генов факторов роста и их рецепторов в условиях экспериментальной ишемии мозга крыс // Доклады академии наук. Т.422(2):258–261.
150. Stavchansky V.V., Yuzhakov V.V., Botsina A.Y., Skvortsova V.I., Bondurko L.N., Tsyganova M.G., Limborska S.A., Myasoedov N.F., Dergunova L.V. 2011. The еffect of Semax and its C-end peptide PGP on the morphology and proliferative activity of rat brain cells during experimental ischemia: a pilot study // J Mol Neurosci 45:177–185
Дата добавления: 2018-10-25; просмотров: 355; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!