Посев уколом в столбик агара или желатины.

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 4

Пробирку с агаром или желатиной держат дном кверху. Материал, подлежащий посеву, берут платиновой иглой, которую отвесно вкалывают в поверхность агара или желатины и продвигают по оси пробирки до самого дна. Иглу затем извлекают, обжигают и закрывают пробирку пробкой.(Рис. 5.3).

Рис. 5.3. Посев уколом в МПА

5.5. Посев в чашку Петри.

Посев в чашку осуществляют, как правило, для получения изолированных колоний микроорганизмов, что позволяет выделять чистые культуры бактерий. Чистой культурой называется совокупность клеток только одного определенного вида. Методов выделения чистых культур существует в основном три: а) посев на чашку Петри, б) посев на элективную (избирательную) среду, в) выделение культуры из организма животного, чувствительного к тому или иному микроорганизму.

Посев на плотную питательную среду можно производить разными методами: с помощью петли – штрихом, с помощью шпателя – рассевом и др.(Рис. 5.4)

Рис. 5.4. Методы посева на плотную среду в чашку Петри.

При посеве шпателем на поверхность агара наносят петлей одну каплю исследуемой бактериальной суспензии. Затем, приоткрыв чашку, прокаленным и остуженным стеклянным шпателем размазывают каплю по всей поверхности, производя легкие поглаживающие движения во все стороны по поверхности агара.

Если необходимо выделить чистые культуры из суспензии с высокой концентрацией бактерий посев можно сделать в несколько чашек не обжигая шпателя. Шпателем распределяют каплю бактериальной суспензии по поверхности среды, затем этим же шпателем протирают поверхность плотной среды последовательно во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Обычно, в первых двух чашках наблюдают сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих - изолированные колонии.

Для получения относительных количественных характеристик микрофлоры на поверхность среды наносят мерное количество бактериальной суспензии с определенной концентрацией клеток. Подсчитывая затем количество выросших колоний.

Рассевать культуру можно петлей методом истощающего штриха. В этом случае петлей берут каплю суспензиии, касаются ей поверхности плотной среды в углу чашки, давая капле стечь, а затем проводят штрихи в таком порядке, как указано на рисунке 5.4

При высокой концентрации клеток каплю суспензии рассевают сначала в первой чашке, а затем той же петлей, не набирая материала, вновь наносят штрихи на второй и третьей чашке с агаром. В первой чашке может получиться сплошной рост, тогда как во второй и третьей наблюдается рост единичных, изолированных колоний.

Каждая колония представляет обособленное скопление клеток – потомков исходной – клон бактерий одного вида. При последующем пересеве из колоний на скошенный агар или другую питательную среду получают чистую культуру.

После посева чашки помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов.

Посевы на поверхность среды делают при культивировании аэробных бактерий. Изолированные колонии анаэробных микроорганизмов получают методом глубинного посева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15-20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную баню, чтобы из среды удалить кислород. Посев проводят следующим образом. В пробирку с расплавленной и остуженной до 48-50° агаризованной средой вносят 0,5-1,0 мл. исследуемой суспензии. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем возле пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри. После того, как среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем, петлёй или извлекают стерильными капиллярными трубками, и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.

Исследования природных субстратов предполагает определение как видового разнообразия бактерий, так и количества их клеток, содержащихся в том или ином объеме субстрата. Число клеток в единице объема можно посчитать различными методами. Иногда, для определения абсолютного числа, проводят прямой счет клеток в исследуемой среде. Однако это отнимает много времени и сил. Часто достаточно относительной количественной оценки. Одним из методов такой оценки является метод высева на плотные среды.

5.6. Определение количества клеток методом высева на плотные среды (чашечный метод). Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. При этом исходят из того, что каждая колония является результатом размножения одной клетки. Чашечный метод особенно широко используется для определения количества микроорганизмов в почве и других естественных субстратах. Однако следует учитывать, что для микроорганизмов, образующих цепочки или другие скопления клеток, результаты по определению их числа будут всегда несколько занижены. Поэтому в микробиологической практике часто используют понятие колониеобразующей единицы (КОЕ). Колониеобразующая единица это одна или несколько клеток, давших начало колонии.

Работа этим методом включает три этапа:

- приготовление разведений,

- посев на плотную среду в чашки Петри,

- подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений. Чтобы получить изолированные колонии, культуру или материал, содержащий микроорганизмы, как правило, разводят – уменьшая концентрацию клеток в единице объёма. Обычно разведения проводят в стерильной водопроводной воде, пользуясь некоторым постоянным коэффициентом разведения, чаще всего равным 10. Таким образом, получают серию разведений, в которых концентрации клеток образуют геометрическую прогрессию. В ходе одного опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, так как в этом случае при большом числе подсчетов уменьшается вероятность ошибки. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл. в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл. исходной суспензии, взятый стерильной пипеткой, переносят в пробирку с 9 мл. стерильной воды—это 1-е разведение, 1: 10. Полученную в 1-м разведении суспензию с помощью новой стерильной пипетки тщательно перемешивают, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3–5 раз, что обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл. полученного разведения и переносят его во 2-ю пробирку—это 2-е разведение, 1: 100. Таким же образом готовят и последующие разведения. (Рис. 5.5) Если используется другой коэффициент разведения, например, 3, тогда 1-е разведение будет 1: 3, 2-е— 1: 9, 3-е—1: 27 и т. д. Степень разведения определяется концентрацией исходной суспензии микроорганизмов и соответственно число разведении тем больше, чем больше концентрация исходной суспензии. Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать отдельную пипетку. Пренебрежение этой предосторожностью может привести к получению ошибочного результата, иногда в 100 и более раз превышающего истинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при каждом разведении. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведении, что и явится причиной получения завышенного результата.

Посев в чашки. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом (см. выше). Перед посевом суспензии поверхностным способом (рис.) в стерильные чашки Петри разливают расплавленную плотную, чаще всего агаризованную, питательную среду. Среду обычно разливают из большой колбы последовательно в ряд чашек Петри по 15—20 мл в каждую, и чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока агаризованная среда не застынет. Поверхность агаровых сред рекомендуется подсушивать, чтобы образующиеся колонии не расплывались по поверхности агара. Для этого чашки с застывшей средой помещают открытыми в сушильный шкаф, нагретый до 70—80°С. Шкаф предварительно необходимо простерилизовать. Среду подсушивают до появления на ее поверхности муаровой пленки. При этом с крышек чашки Петри удаляется конденсационная вода. В некоторых случаях агаризованную среду подсушивают, помещая чашки в термостат на 2—3 суток крышками вниз. Когда среда готова, на ее поверхность стерильно пипеткой наносят строго определенный объем (0, 05—0, 2 мл) соответствующего разведения.

Рис. 5.5. Схема приготовления последовательных разведений бактериальной суспензии.

Этот объем распределяют стерильным стеклянным шпателем по поверхности агаризованной среды в чашке Петри. Высевы на плотную среду производят обычно из трех последних разведении. Из каждого разведения делают 2—4 параллельных высева. Посевы из разведении можно делать одной пипеткой, но начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель.

Выросшие колонии подсчитывают, определяя концентрацию клеток в определенном объеме того или иного разведения. Трудно не заметить возможность использования этого метода и для выделения чистых культур микроорганизмов. Изолированные колонии – прекрасная возможность отсеять небольшое количество клеток на скошенный стерильный МПА.

В качестве исследуемого по такой схеме субстрата может быть не только вода или почва, но и воздух. Для этого на стерильный бумажный фильтр (предварительно взвешенный) осаждают клетки, прокачивая определенное количество воздуха. Затем фильтр помещают в стерильную воду или физиологический раствор, где клетки смывают готовя суспензию. Приготовленную суспензию исследуют, как было описано выше.

Метод секторных посевов

Для определения числа микробных клеток в 1 мл бактериальной суспензии (в частности мочи при клинических анализах) можно использовать метод секторных посевов. Платиновой петлей, диаметром 2 мм, емкостью 0,005 мл, производят посев суспензии (30-40 штрихов) на сектор А чашки Петри с питательным агаром. После этого петлю прожигают и производят 4 штриховых посева:

- из сектора А в сектор 1

- из сектора 1 в сектор 2

- и аналогичным образом - из сектора 2 в 3.

Рис. 5.1 Схема секторных посевов

Чашки инкубируют при 37°С 18-24 часа, после чего подсчитывают число колоний, выросших в разных секторах. Определение степени микробной загрязнённости исследуемой суспензии по количеству выросших колоний производят согласно таблице 1.

Таблица 1

Количество колоний в секторах				Количество бактерий в 1 мл. суспензии
А	1	2	3	Количество бактерий в 1 мл. суспензии
	0	0	0	Менее 10³
1-6	0	0	0	3*10³
8-20	0	0	0	5*10³
20-30	0	0	0	10⁴
30-60	0	0	0	5 *10⁴
70-80	5-10	0	0	10⁵
100-150	20-30	0	0	5 *10⁵
Более 200	40-60	0	0	10⁶
-“-	100-140	10-20	0	5 *10⁶
-“-	Более 200	30-40	0	10⁷
-“-	-“-	60-80	Единичные колонии	10⁸
-“-

Метод секторных посевов позволяет не только определить степень загрязнённости суспензии, но и выделить чистые культуры микроорганизмов.

Важно отметить, что схема исследования суспензий в принципе одинакова для самых разных случаев, в том числе при изучении микрофлоры воздуха или смывов с любой поверхности.

5. 4 Метод "тампон-петля":

Смывы с поверхности можно исследовать методом “тампон – петля”. Материал, взятый ватным стерильным тампоном, засевают на плотную питательную среду (МПА). Посев на чашку с агаром производят методом “тампон – петля”.(См. рис. 5.2)

- тампоном проводится "дорожка" по диаметру чашки,

- затем другой стороной тампона в обратном направлении засевается еще одна "дорожка", параллельная первой,

- материал рассевают по чашке при помощи петли штрихами, перпендикулярными к "дорожкам".

Такой посев позволяет выделить микроорганизмы в виде отдельных колониеобразующих единиц даже из ассоциации микроорганизмов. Засеянные питательные среды термостатируют при 37°С в течение 18-24 часов. При обнаружении роста производят отсев отдельных колоний на стерильные среды с целью их идентификации. При отсутствии роста в первые сутки посевы оставляют в термостате, ежедневно просматривают. Ответ об отсутствии роста выдают через 5 суток термостатирования.

Рис.5.2 Схема посева “тампон-петля”

Схема посева при выполнении этого метода может быть и несколько иной. Тампоном делают не полоски а пятна – отпечатки, которые затем расштриховывают петлёй.

5.6 Транспортировка инфекционного материала

Доставка инфекционного материала в лабораторию осуществляется в специальном металлическом футляре, биксе и т.п. Не допускается перевозка инфекционного материала в хозяйственных сумках, чемоданах, портфелях и других предметах личного пользования. Распаковка материала, присланного в лабораторию для исследования, проводится с соблюдением мер предосторожности: банки и пробирки, содержащие материал, обтирают дезинфицирующим раствором и ставят на металлические подносы или штативы.

Перенос инфекционного материала из одной лаборатории в другую на территории учреждения осуществляется в специально приспособленной опломбированной металлической посуде (металлических баках, биксах). За пределы данного учреждения инфекционный материал выносится в запаянных ампулах, флаконах и пр., завернутых в лигнин или гигроскопическую вату и помещенных в металлический сосуд (пенал) с плотно закрывающейся крышкой, опломбированной или опечатанной сургучной печатью. Документация оформляется в соответствии с действующим Положением (см. пункт 1.5а).

Список литературы

Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы министерства здравоохранения СССР УТВЕРЖДЕНЫ Президиумом ЦК профсоюза медицинских работников 2 октября 1981 г., протокол N 58 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель Министра здравоохранения СССР, Главный государственный санитарный врач СССР П.Н.БУРГАСОВ 20 октября 1981 г. N 2455-81

1. Блохина И.Н., Ладыгина Г.Н., Соколова К.Я., Залесских Н.В., Коровенков А.Н. Методы идентификации бактерий. Учебное пособие. Горький. Изд.ГГУ, 1986. 76 с.

2. Борисов Л. Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Уч. пособие. М. Медицина. 1993. 240 с.

3. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М. Изд. МГУ, 1987. 256 с.

4. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. (Теория и практика). М. Мир. 1967. 348 с.

5. Пименова М.И., Гречушкина Н.Н., Азова Л.Г. Руководство к практическим занятиям по микробиологии (малый практикум). М. Изд. МГУ, 1971. 222 с.

6. Практикум по микробиологии.// учебное пособие. Под редакц. Н.С.Егорова. М. Изд-во моск. ун-та. 1976. 307 с.

7. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем ДЖ.. Мир микробов. в 3 т. М.Мир.1979. т.3. 486 с.)

8. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О. Биргера. М. Медицина. 1982. 464 с.

9. Утевский Н.Л. Элементы медицинской микробиологии и медицинской техники. М.Медгиз.1952. 303 с.

10. Никитин Д.П., Новиков Ю.В., Рощин А.В.Справочник помошника санитарного врача и помошника эпидемиолога. М. Медицина. 1990. С. 512. Изд-е второе. Под редакц. Д.П. Никитина, А.И. Заиченко

11. Определитель бактерий Берджи. В 2-х томах. Перев. С англ./ Под редакц. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. М. Мир. 1997. Т. 1. С. 432., т. 2. С. 368.

Дата добавления: 2018-09-23; просмотров: 2808; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 34

Мы поможем в написании ваших работ!