Методы стерилизации высокой температурой
3.1.1. Прокаливание в пламени - самый быстрый и надежный метод. Этим методом стерилизуют бактериологические петли, иглы, пинцеты, предметы из стекла и другие мелкие инструменты.
Для стерилизации обрабатываемый материал (предмет) несколько раз проводят через пламя горелки. При прокаливании происходит сгорание микроорганизмов и их спор. Следует отметить, что прокаливание режущих предметов приводит к их порче, а стеклянные предметы часто лопаются и плавятся, что ограничивает возможность этого метода.
Разновидностью этого метода можно считать прокаливание факелом, применяемое для стерилизации различных поверхностей: столов, внутренних поверхностей оборудования и т.д.
3.1.2. Стерилизация сухим жаром. Стерилизация сухим жаром (или горячим воздухом) – проводится в сушильных шкафах (печах Пастера). Этим методом стерилизуют пробирки, пипетки, колбы, чашки Петри, другую стеклянную посуду и металлический инструмент. Перед стерилизацией посуду хорошо моют, высушивают, закрывают ватными пробками пробирки и колбы, пипетки и чашки заворачивают в бумагу или помещают в большую общую ёмкость. Стерилизация проводится при 160 - 180° в течение 1 - 1,5 часов с момента достижения этой температуры.
3.1.3. Кипячение - простейший способ стерилизации игл, шприцев и хирургических инструментов. Кипячение проводят в стерилизаторах в течение 10 - 15 мин. с добавлением 1-2% раствора соды, что устраняет жесткость воды и предохраняет металлические предметы от ржавчины после кипячения. Этот метод не обеспечивает полной стерилизации, так как споры некоторых бацилл и клостридий выдерживают кипячение в течение нескольких часов.
|
|
|
3.1.4. Стерилизация паром под давлением. Самый эффективный в бактериологической практике способ стерилизации. Даже однократная стерилизация паром под давлением уничтожает не только вегетативные, но и споровые формы бактерий. Производится стерилизация в автоклавах. В автоклавах стерилизуют питательные среды, лабораторную посуду, отработанные культуры. Автоклав впервые введен в практику нашим соотечественником Гейденрейхом в 1884 г.
Режим работы автоклава:
| Давление | ТоС |
| 0,5 атм. | 110° - 122°С |
| 1 атм. | 121° - 122°С |
| 1,5 атм. | 127°С |
| 2 атм. | 152°С |
1. МПА, МПБ посуда: 1 атм. - 50 мин.;
2. среды, содержащие сахара: 0,5 атм. 15 - 20мин.; при более высокой температуре происходит карамелизация сахара.
3.1.5. Тиндализация. Проводится с целью уничтожения микроорганизмов в веществах, легко разрушающихся и денатурирующихся при температуре больше 60°. Прогревание проводится в водяных банях или других приборах при температуре 56 - 60°. в течение часа с 5 - 6 кратным повторением через каждые 24 часа. В интервалах между прогреваниями материал выдерживается при комнатной температуре. За это время споровые формы микробов прорастают и превращаются в вегетативные, которые погибают при повторных прогревах.
|
|
|
3.1.6. Пастеризация. Однократное прогревание материала в течение 1 часа при температуре 65 - 70° или 5-10 мин. при 75 - 80°. Этот метод направлен на уничтожение вегетативных форм, преимущественно патогенных м.о. Споровые же формы и многие сапрофиты сохраняются. Применяется этот метод для обеспложивания молока, пива, вина и др. продуктов. При пастеризации полностью сохраняются витамины и вкусовые качества продукта. Пастеризованные продукты долгому хранению не подлежат.
3.2. Стерилизация фильтрованием
Стерилизация фильтрованием применяется для освобождения от микроорганизмов различных жидкостей (питательных сред и др.), которые нельзя подвергать воздействию высокой температуры. Этим методом механически отделяют микроорганизмы от субстрата.
Фильтр Зейтца - круглые асбестовые пластины, вставленные в механические держатели.
Свечи Шамберлана - небольшие полые цилиндры с определенным диаметром пор, обозначаемых номерами. Фильтрование ведется под давлением или в вакууме. Для генерации свечей их кипятят в водопроводной воде, а затем прокаливают в муфельной печи.
|
|
|
Мембранные фильтры - из нитроцеллюлозы (нитроклетчатки), они обозначены номерами в зависимости от диаметра пор (от 350ммк. до 1200 ммк.). Стерилизуют их кипячением в дистиллированной воде в течение 20 мин.
3.3. Стерилизация излучениями
Стерилизация УФ-лучами - применяется главным образом для стерилизации воздуха помещений. Ультрафиолетовое излучение обладает высокой повреждающей активностью, поэтому КАТЕГОРИЧЕСКИ ЗАПРЕЩАЕТСЯ НАХОДИТЬСЯ В ПОМЕЩЕНИИ ПРИ РАБОТАЮЩЕМ УФ ИЗЛУЧАТЕЛЕ.
Для стерилизации некоторых объектов используют и другие виды излучений: жесткое ионизирующее излучение, поток электронов и др.
3.4. Химическая стерилизация
Химическая стерилизация основана на губительном действии химических веществ на микробы. Химические вещества применяются для уничтожения микроорганизмов в различных ситуациях: в объектах внешней среды, на рабочем месте, в помещениях. Ими стерилизуют рабочую одежду, моют руки и т.д. В случаях, когда уничтожаются патогенные микроорганизмы, говорят о дезинфекции. После дезинфекции в том или ином материале или среде могут сохраняться жизнеспособные сапрофиты. Понятие “стерилизация” шире понятия “дезинфекция”. Для дезинфекции применяют:
|
|
|
- 3 - 5 % раствор фенола,
- 0,5 - 2 % раствор формалина,
- 10% р-р хлорной извести,
- 0,5 - 5% р-р хлорамина,
- р-р йода, сулемы, (дезинфицируют столы в операционных) и др.
Для консервирования вакцин и лечебных сывороток пользуются фенолом (0, 25–5%), формалином (0, 05%), хлороформом (0, 5%). Глицерин, борную кислоту и толуол употребляют для консервирования агглютинирующих сывороток.
Предметы, загрязненные патогенными микробами, во время лабораторной работы дезинфицируются:
3% раствором перекиси водорода с моющим средством,
1% раствором сулемы,
3% раствором фенола,
2,5% раствором крезола,
1–3% раствором хлорамина,
1 % осветленным раствором хлорной извести
700 спиртом,
выделения больных (кал, мокрота и др.) – сухой хлорной известью (200 г на 1 л выделений).
Рабочие поверхности можно стерилизовать 0,5% раствором молочной кислоты.
3. ПОДГОТОВКА ПОСУДЫ, ИНСТРУМЕНТОВ, ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА.
4. РЕЦЕПТЫ НЕКОТОРЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
4.1. Посуда.
Приготовленные среды разливают в стеклянную посуду (матрацы, флаконы, пробирки и т. д.). Бывшую в потреблении посуду стерилизуют, моют теплой водой с помощью ерша или щетки, после чего ополаскивают 2—3 раза дистиллированной водой и сушат. Если посуда с трудом поддается обычному мытью, ее обрабатывают в течение 30 минут хромовой смесью (на 1 л воды 50 г двухромовокислого калия, 100 г технической серной кислоты), хорошо промывая после этого водой, и сушат. Посуду со следами агара, желатины и других питательных сред можно замачивать за сутки перед мытьем в растворе щелока. Для обесцвечивания не отмывшейся краски употребляют 3% раствор хлорной извести.
Посуду, применяемую для питательных сред, нельзя использовать для дезинфицирующих веществ. Примесь последних делает питательную среду негодной.
Пробирки, колбы, матрацы и другие емкости для культивирования микробов, перед стерилизацией закрывают ватными пробками, а иногда дополнительно заворачивают в бумагу.
Чашки Петризаворачивают в бумагу по одной или помещают в большую закрывающуюся емкость и автоклавируют.
Сушить посуду следует или в сушильном шкафу, или в комнате-сушилке с температурой до 50° и хорошей вентиляцией.
Ватные пробки.
Сухие пробирки, колбы, флаконы, бутыли перед стерилизацией закрывают ватными пробками, которые готовят следующим образом. Кладут на стол продолговатую четырехугольную пластинку ваты соответствующей величины, загибают внутрь все четыре края так, чтобы получилась ленточка, по ширине равная длине пробки, и скатывают валик по диаметру пробирки или колбы. Ватную пробку можно обертывать кусочком марли в один слой. Края марли связывают снаружи над пробкой ниткой.
4.3. Пастеровские пипетки.
Стеклянную трубку диаметром 5—6 мм вносят в пламя горелки, нагревают до размягчения стекла и, вынув из пламени, аккуратно растягивают концы трубки в разные стороны. Стерилизуют, помещая пипетки в большой стеклянный цилиндр.
Микробиологические петли.
Берут отрезок нихромовой проволоки (10—12 см. длиной) и при помощи пинцета на одном конце делают петлю диаметром 4-5 мм. Затем один конец стеклянной палочки сильно расплавляют на большом огне и к нему припаивают заготовленную вышеуказанным образом проволоку. Вместо стеклянной палочки часто используют специальный держатель. Петли различаются по диаметру, что позволяет специалисту брать петлёй капли жидкостей разных объёмов. Кроме набора петель у микробиолога имеется бактериологическая игла, используемая для работы с мелкими колониями бактерий. Стерилизуют непосредственно перед работой, и после соприкосновения с инфицированным материалом в пламени горелки.
Стеклянный шпатель.
Стеклянную палочку необходимой толщины вводят в пламя горелки, нагревают до размягчения, конец обжимают предварительно нагретыми плоскогубцами, сгибают два раза, образуя треугольник. Стерилизуют перед работой в пламени горелки или погружая в спирт с последующим прокаливанием.
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
 | |||||||||||||
6
 |
1 2 3 4 5 7
Рис. 1. Набор основных инструментов: 1 – бактериологическая игла, 2 – петля, 3 – пастеровская пипетка, 4 – мерная пипетка, 5- шпатель, 6 – спиртовка, 7–чашка Петри.
Пипетки.
В микробиологической лаборатории широко пользуются пипетками. Пипетки бывают пастеровские и градуированные. Первые не имеют делений, и расчет жидкости при работе с ними ведется на капли; вторые имеют деления, и количество вытекающей из них жидкости определяется более точно. Отсчитывание измеряемой жидкости производится по делениям сверху вниз (так, например, если нужно градуированной пипеткой в 5 мл отмерить 3,5 мл, то набирают жидкость до 0, а затем выливают до 3,5).
При подготовке к стерилизации в верхний, широкий конец пипетки вкладывают кусочек ватки, которая в дальнейшем будет служить фильтром в случае вытекания суспензии из пипетки в грушу. Пипетки заворачивают в бумагу или помещают в закрываемый цилиндр. После работы пипетки погружают в стерилизующий раствор на 2-3 см. выше уровня насасывания бактериальной суспензии.
В последнее время широко используются микродозаторы, позволяющие достаточно удобно и просто отмерять определенные объемы жидкостей одним двумя нажатиями на поршень. Сменные наконечники таких дозаторов одноразовые.
4.7. Физиологический раствор. На 1 л дистиллированной воды берут 8,5 г поваренной соли, растворяют и фильтруют через бумажный фильтр. Затем разливают во флаконы и стерилизуют автоклавированием. Часто для приготовления бактериальной суспензии готовят растворы с определённым рН..
Питательные среды
Культивирование микроорганизмов производят с использованием питательных сред. Питательная среда – субстрат, содержащий все необходимые для развития микроба компоненты и отвечающий определенным требованиям. Питательные среды делятся по назначению, происхождению и консистенции.
По происхождению:
естественные и искусственные (из искусственных выделяют в особую группу синтетические среды, их готовят из химически чистых веществ солей, углеводов, аминокислот и др., взятых в определенных соотношениях).
По консистенции:
жидкие: мясная вода, Мясо-Пептонный Бульон (МПБ), бобово-пептонный бульон и др.
полужидкие: готовятся на основе жидких путем добавления 0,25% агара.
плотные: Мясо-Пептонная Желатина (МПЖ), Мясо-Пептонный Агар (МПА) и другие (готовят добавляя к жидкой среде 10-15% желатины или 1,5-2% агара).
По назначению:
Простые (обычные) - применяются для культивирования и накопления массы клеток большинства микроорганизмов: МПБ, МПА, МПЖ и др.
Элективные и накопительные - пригодные для выращивания одного приспособленного к данным условиям вида м.о. Сопутствующие м.о. или не растут на такой среде или развитиеих сильно задерживается. Пример - щелочно-пептонная вода (для холерного вибриона); среда Эшби для азотобактера.
Дифференциально-диагностические - применяются для изучения биохимических свойств микробов, а в особых случаях для выделения чистых культур некоторых микроорганизмов. Среды Гисса - жидкие среды с углеводами; среда Эндо - плотная среда с индикатором для кишечной палочки.
Требования, которым должна удовлетворять всякая питательная среда:
– Содержать необходимые для микроорганизмов питательные вещества: источники азота, углерода, кислорода, водорода и неорганические соли; факторы роста.
– Быть стерильной.
– Быть достаточно прозрачной, что обеспечит хорошее наблюдение за характером роста культуры и теми изменениями, которые происходят в среде в результате роста микроорганизмов.
– Иметь соответствующую реакцию среды.
Но не все микроорганизмы можно выращивать в искусственных условиях. В этом отношении вирусы и риккетсии отличаются от всех других микробов: будучи облигатными (обязательными) паразитами, они не способны размножаться вне бактериальной клетки.
4.9 Рецепты некоторых приготовляемых в лаборатории сред.
4.9.1 Кровяной агар.
В качестве основы используют сухой питательный агар. По прописи, указанной на этикетке, готовят 2% агар, рН 7,4-7,6. К расплавленному и охлажденному до 45°С агару, соблюдая правила асептики, добавляют 5% (5 мл крови на 100 мл питательной среды) дефибринированной бараньей, лошадиной или кроличьей крови, цитратной или дефибринированной крови человека без антибактериальных препаратов.
Смесь тщательно перемешивают, чтобы не образовалось пены, и разливают в стерильные чашки Петри, предварительно подогретые в термостате, слоем 3-4 мм. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет. Хранят не более двух недель в целлофановых мешках при 4°-6°С.
4.9.2 Агар с гретой кровью (шоколадный агар)
Прогревание крови способствует освобождению из эритроцитов факторов роста X (гемин) и V (никотинамидадениндинуклеотид), необходимых для культивирования гемофилов.
А) К 100 мл расплавленного и охлажденного до 80°С питательного агара, рН 7,4, добавляют 10 мл дефибринированной крови лошади или человека (без консервантов), тщательно перемешивают, после чего помещают в водяную баню и, постоянно встряхивая, держат при температуре 70°-80°С до тех пор, пока цвет агара не станет шоколадным (25-30 мин.).
Б). 5 мл дефибринированной крови кролика и 100 мл питательного агара тщательно взбалтывают и ставят на 2-3 минуты в водяную баню при 80°С. Затем добавляют еще 5 мл крови и вновь ставят в водяную баню на 2-3 минуты. При приготовлении шоколадного агара следует обратить внимание на правильный прогрев, при слишком слабом прогреве агар будет иметь коричнево-красный цвет, при слишком сильном - темно-коричневый. Шоколадный агар должен иметь светло-коричневую окраску.
Среду разливают в чашки Петри. Хранят не более двух недель в целлофановых мешках при 4°-6°С.
4.9.3 Сахарный бульон
К 100 мл питательного бульона, рН 7,2-7,4, прибавляют 1 г глюкозы. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или при 0,5 атм. 30 минут.
4.9.4 Сывороточный бульон
К 80 мл стерильного питательного бульона, рН 7,2-7,4, стерильно добавляют 20 мл лошадиной или бычьей сыворотки. Среду разливают в пробирки по 5 мл, выдерживают 2 суток в термостате для контроля стерильности, а затем хранят в
холодильнике.
4.9.5 Сывороточный агар
В качестве основы используют 1,5% агар, рН 7,4, тиамин-цистин-глутаминовый. К 90 мл расплавленного и остуженного до температуры 50°С агара добавляют 10 мл инактивированной при температуре 56°С в течение 30 минут сыворотки, консервированной хлороформом, или без консерванта. После перемешивания среду разливают в чашки.
Среда годна к употреблению только в течение 48 часов при хранении ее в холодильнике. Перед посевом чашки, хранившиеся в холодильнике, должны быть подогреты до температуры 37°С.
4.9.6 Среда Тароцци
Нежирное мясо или печень (можно плаценту) нарезают мелкими кусочками и заливают трехкратным количеством питательного бульона, рН 7,4-7,6. Кипятят 30 минут. Затем бульон фильтруют, а кусочки мяса или печени промывают на сите водопроводной водой и просушивают фильтровальной бумагой.
Распределяют во флаконы по 15-20 г (8-10 кусочков) и в пробирки по 2-3 кусочка печени или мяса и заливают по 300 мл бульона во флаконы и по 5-6 мл в пробирки. Стерилизуют 30 мин. при 1 атм.
4.9.7 Желточно-солевой агар
В качестве основы используют элективный солевой агар для стафилококков. По прописи, указанной на этикетке, готовят 1,8-2% агар, рН 7,2-7,4. К расплавленному и охлажденному до 45°-50°С агару, соблюдая правила асептики, добавляют 20% желточной взвеси (асептически извлеченный из яйца желток взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия).
Смешивают тщательно агар с желточной взвесью, разливают по 20 мл в чашки Петри. Хранят в холодильнике в течение двух недель.
4.9.8 Среда Хью-Лейфсона
Среда позволяет уловить изменения рН даже при слабом окислении углеводов, что достигается заменой аминокислот питательной среды пептоном. В этой среде отсутствуют щелочные продукты расщепления аминокислот, которые могут нейтрализовать кислые продукты при утилизации углеводов.
Ингредиенты:
Пептон - 2,0 г
Натрий хлористый - 5,0 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный (К2НРО4) - 0,3 г
Глюкоза - 10,0 г
Агар - 3,0 г
Бромтимоловый синий - 0,03 г
Дистиллированная вода - 1000,0 мл
К воде прибавляют пептон, натрий хлористый и агар. Смесь подогревают до расплавления агара. Затем добавляют калий фосфорнокислый двузамещенный и глюкозу. Продолжают кипятить 2-3 минуты. Смесь подщелачивают 20% раствором едкого натра до рН 7,4-7,5, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1% водного раствора бромтимолового синего.
Среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 10-15 мл в стерильные пробирки. Стерилизуют при 0,5 атм. 20 минут. Цвет среды до стерилизации - синий, после автоклавирования - травянисто-зеленый, рН 7,1-7,2. При кислом рН среда желтеет.
4.9.9 Среда Сабуро
На 1 л дистиллированной воды 10,0 г пептона, 18,0 г агар-агара. Нагревают до расплавления агара, добавляют 40,0 г глюкозы, рН 5,8, стерилизуют при 0,5 атм. (116°С) 30 минут.
4.9.10 Селенитовый бульон
Среда обогащения - для накопления сальмонелл и шигелл.
Ингредиенты:
Натрий селенистокислый кислый (NаНSеО3) - 4 г
Пептон - 5 г
Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2НРО4) - 7 г
Натрий фосфорнокислый однозамещенный (NаН2РО4) - 3 г
Лактоза - 4 г
А). Основной питательный раствор включает пептона - 5 г, натрия фосфорнокислого двузамещенного - 7 г, натрия фосфорнокислого однозамещенного - 3 г, лактозы - 4 г, дистиллированной воды - 1000 мл, рН раствора 6,9-7,1. Стерилизуют текучим паром два дня подряд по 30 мин. Срок хранения при 4-6°С в течение 1-2 месяцев.
Б). 10% раствор кислого селенистокислого натрия готовят на стерильной дистиллированной воде extempore. Раствор селенита стерилизации не подлежит.
Для получения готовой среды (extempore) 2 мл 10% раствора кислого селенистокислого натрия добавляют к 50 мл основного раствора. Приготовленную среду по 5 мл асептически разливают в стерильные пробирки с хорошо подогнанными пробками. Стерилизацию готовой среды не производят.
4.9.11 Среда Эшби. (рецепт в г/л дистиллированной воды)
Для выделения азотфиксаторов используют элективную среду Эшби. В её составе отсутствует азот, в какой бы то ни было форме.
Ингридиенты:
маннит, или глюкоза, или сахароза 20
К2НРО4 0.2
MgSO4 0.2
NaCl 0.2
K2SO4 0.1
CaCO3 5.0
Среду стерилизуют: при одной атмосфере – основу, и затем добавив углевод стерилизуют еще раз при 0.5 атм. Для получения плотной среды Эшби её уплотняют агар – агаром и разливают в чашкиДля выделения нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий используют синтетические накопительные среды следующего состава.
4.9.12 Среда Виноградского (в г/л дистиллированной воды)
Для нитрификаторов первой стадии:
(NH4)2SO4 2.0
K2HPO4 1.0
MgSO4 0.5
NaCl 2.0
FeSO4 0.4
CaCO3 5.0
Для нитрификаторов второй стадии:
NaNO2 1.0
Na2CO3 1.0
NaCl 0.5
K2HPO4 0.5
MgSO4 0.5
FeSO4 0.4
CaCO3 5.0
Среды стерилизуют 20 мин. при 1 атм.
4.9.13 Среда Гильтея для денитрификаторов (в г/50 мл. дистиллированной воды)
Готовят:
KNO2 0.4
аспарагин 0.2
KH2PO4 0.2
MgSO4 2.0
CaCl2 0.2
FeCl3 следы
натрий лимоннокислый 5.0
вода дистиллированная 50 мл.
Раствор доводят до 1000 мл. и устанавливают рН 7.0. Стерилизуют при 0.5 атм. в течение 20 минут.
5. МЕТОДЫ ПОСЕВОВ, ПЕРЕСЕВОВ И ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
Дата добавления: 2018-09-23; просмотров: 849; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!