Ориентировочная реакция агглютинации
Список практических навыков
Приготовление фиксированного мазка
Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят взвесь бактерий и равномерно распределяют ее по поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе или в пламени спиртовки. Высушенные мазки подвергают фиксации, в результате которой бактерии погибают и прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло проводят несколько 3 раз через пламя горелки. Иногда мазки фиксируют химическим способом (спиртами, смесью Никифорова и т.д.).
Окраска фиксированного мазка простым методом
Фиксированный мазок помещают на «салазки» в кювету, дают ему остыть и наносят на него пипеткой несколько капель красителя на 2-3 мин. Затем смывают водой и высушивают препарат фильтровальной бумагой.
3. Окраска фиксированного мазка по методу Грама:
1. На фиксированный мазок нанести основной краситель - генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин.
2. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин.
3. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек.
4. Промыть водой.
5. Нанести раствор водного фуксина на 1-2 мин.
6. Промыть водой, высушить.
4. Питательные среды:
Среда Эндо - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к дифференциально-диагностическим. Применяется для посева и выделения энтеробактерий. До посева имеет розоватый цвет.
|
|
|
Состав: МПА - питательная основа; лактоза - дифференциальный фактор; фуксин, нейтрализованный гипосульфитом - индикатор на РН.
Принцип работы среды - если выросшие микроорганизмы расщепляют лактозу, среда закисляется, РН меняется в кислую сторону, колонии будут окрашенными в тёмнокрасный цвет иногда с металлическим блеском. Так выглядят на этой среде колонии кишечной палочки. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.
Среда Плоскирева - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения патогенных энтеробактерий. До посева имеет цвет обычного МПА.
Состав: МПА - питательная основа; соли желчных кислот - элективный фактор; лактоза - дифференциальный фактор; нейтральный красный - индикатор на РН.
Принцип работы среды - соли желчных кислот подавляют рост непатогенных энтеробактерий (они могут расти на этой среде, но не через 24 часа, а позже - через 48); если микробы расщепляют лактозу, колонии будут окрашены в красный цвет. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.
Среда ЖСА (желточно-солевой агар) - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения стафилококков.
|
|
|
Состав: МПА - питательная основа; 10%NaCl - элективный фактор; лецитин куриного желтка – дифференциальный фактор.
Принцип работы среды - 10% NaCl подавляют рост других микробов, поэтому на ней вырастают преимущественно стафилококки; если стафилококки продуцируют фермент лецитовителлазу, расщепляющий лецитин, вокруг таких колоний появляется зона помутнения. Чаще всего так выглядят на ЖСА колонии Staphylococcus aureus.
Посев по методу Дригальского
Посев производится на трех занумерованных чашках Петри (I, II, III) с питательной средой. Для посева используются шпатели, завернутые в бумагу и простерилизованные.
1. На поверхность питательной среды в чашке I наносят петлей й каплю исследуемого материала и растирают ее стерильным шпателем по всей поверхности питательной среды.
2. Вынимают шпатель из чашки I, закрывают ее и быстро переносят шпатель в чашку II, не прожигая его. Растирают материал по всей поверхности среды. Чашку II закрывают.
3. Так же переносят шпатель в чашку III и растирают материал по поверхности питательной среды . Закрывают чашку. Шпатель опускают в дезинфицирующую жидкость.
|
|
|
4. Чашки надписывают (название материала, фамилия больного, дата) и помещают в термостат .Чашки находятся в термостате 18—24 часа.
6. Определение биохимических свойств микробов:
Сахаролшпические свойства изучают на средах Гисса.
Среды Гисса - жидкие сложные питательные среды, по классификации сред относятся к дифференциальным
Состав: ПВ - питательная основа; углевод - дифференциальный фактор; индикатор Андреде - индикатор на РН. В пробирку, содержащую глюкозу, помещен "поплавок" - маленькая перевернутая пробирка. Среды до посева соломенно-желтого цвета.
Принцип работы среды - если засеянная в среду культура расщепляет соответствующий углевод, цвет среды меняется на красный, так как среда закисляется. Глубина расщепления углеводов оценивается по глюкозе, при расщеплении которой видно не только закисление по покраснению среды, но и газообразование, которое видно в виде пузырька газа в "поплавке".
Протеолитические свойства - на пептонной воде. Для определения глубины расщепления белка под пробки помещены: лакмусовая бумага (посинеет при образовании NH3); фильтровальная бумага, смоченная уксуснокислым свинцом (почернеет при образовании H2S); реактив Эрлиха добавляют для определения индола (среда, содержащая индол покраснеет).
|
|
|
7. Определение чувствительности к антибиотикам методом стандартных дисков:
Исследуемую культуру засевают газоном на чашку Петри с плотной питательной средой (чаще всего на МПА). На засеянную поверхность среды сразу же раскладывают (не более 6 на чашку) стандартные бумажные диски, содержащие антибиотики (30 мкг). Каждый диск маркирован тремя буквами от названия соответствующего антибиотика. Засеянные чашки помещают в термостат. Через 24 часа учитывают результат, измеряя диаметр зоны задержки роста. Чувствительность культуры к антибиотику определяют по таблице, но ориентировочно можно считать: до 12 мм - устойчив, до 20 – умеренно устойчив, более 20 - чувствителен.
8. Качественная проба на бактериофаг по Отто:
На чашку Петри с МПА газоном засевают известную культуру (например Е. coli), затем наносят каплю фильтрата, содержащую неизвестный бактериофаг, дают ей стечь по поверхности засеянного МПА. Чашку помещают в термостат. Через 24 часа учитывают результат. Если по ходу стекающей капли культура не выросла, образовалась "стерильная дорожка", значит в фильтате содержался бактериофаг, лизирующий данную культуру (в нашем случае - колифаг).
9. Фаготипирование стафилококков:
Дно чашки Петри с МПА делят на квадраты, каждый из которых подписывают цифрами, соответствующими номерам типовых стафилофагов. На подготовленную чашку газоном засевают исследуемый штамм S.aureus и в каждый квадрат капают соответствующий типовой стафилофаг. Засеянную чашку с культурой и бактериофагами помещают в термостат. На другой день учитывают результат фаготипирования, отмечая номера типовых стафилофагов, лизировавших культуру (в соответствующих квадратах будут видны "стерильные пятна"). Фаготип - перечень типовых бактериофагов, лизировавших данную культуру. Это - один из приемов внутривидового типирования, позволяющий установить источник инфекции и пути распространения.
10. Титрование вируса полиомиелита в цветной пробе Солка:
В пробирках находится вируссодержащий материал в соответствующих разведениях и культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.
В контрольной пробирке содержится только культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.
Штатив помещают в термостат. Просматривают ежедневно. После того как в контрольной пробирке цвет среды изменится с красного на желтый, что свидетельствует о том, что культура клеток жива, штатив извлекают из термостата и учитывают результат. Титром вируса является наибольшее разведение, в которой произошла гибель клеток и цвет среды поэтому не измененился, остался красным.
Серологические реакции
Ориентировочная реакция агглютинации
Ориентировочную реакцию агглютинации ставят на предметном стекле.Наносят пастеровской пипеткой каплю физиологического раствора, затем в ней тщательно размешивают небольшое количество культуры до получения гомогенной взвеси бактерий. Рядом с первой каплей наносят каплю сыворотки в разведении 1 : 10, 1 : 20, и смешивают обе капли.Через несколько минут в случае положительного результата наблюдается образование агглютината , которое еще ускорится, если слегка покачивать стекло.
2. Реакция развернутой агглютинации с целью серотипирования E. сoli применяется для подтверждения результатов ориентировочной реакции агглютинации с моновалентными сыворотками.
Сначала готовят основное разведение взвеси микроорганизмов (1:50), из которого делают серию разведений путем последовательного переноса 0,5 мл из предыдущей пробирки в следующую пробирку ряда (0,5 + 0,5 физраствора). Из последней пробирки 0,5 мл разведенной взвеси удаляют для сохранения одинакового объема. В контрольную пробирку (контроль антигена) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия.
В каждую пробирку с разведениями и в контрольную пробирку вносят пастеровской пипеткой по 2 капли моновалентной сыворотки. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 ч, затем сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: "++++" — полная агглютинация (хлопья агтлютината в абсолютной прозрачной жидкости), "+++" — неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости), "++" — частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная), "+" — слабая , сомнительная агглютинация (жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы), "—" — отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
3. Титрованне агглютинирующей сыворотки
Тип реакции: реакция агглютинации.
Исследуемый материал: сыворотка животного, гипериммунизированного бактериальной взвесью.
Диагоностический препарат: взвесь убитых бактерий, применявшихся для гипериммунизации.
Принцип метода: к серийным разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют равные количества взвеси убитых бактерий, применявшихся для получения этой сыворотки.
Положительный результат реакции: образование хлопьев, просветление жидкости. Отрицательный результат: равномерная муть. Применение: для определения титра агглютинирующей сыворотки.
Титр агглютинирующей сыворотки -наибольшее разведение сыворотки, в которой еще наблюдается агглютинация. В данном случае титр агглютинирующей сыворотки равен ...
Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 306; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!