III. Ядерно-белковый матрикс.

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 6Следующая ⇒

ЯБМ не имеет четкой морфологической структуры. Он выявляется как отдельный компонент при экстракции из ядер практически всех участков хроматина, РНК, и липопротеидов ядерной оболочки. В зависимости от условий выделения различают 2 типа ЯБМ: ЯБМ I типа и ЯБМ II типа.

	ЯБМ I типа (выделяется при помощи Ca²⁺)	ЯБМ II типа (выделяется при помощи ЭДТА)
белки	8-15%	1-3%
ДНК	1-2%	0,1-0,3%
РНК	20-30%	0,4-2%

IV. Препараты и микрофотографии.

Препараты.

1. Включение ³НТ в клетки культуры СПЭВ. Расчет пролиферативного пула.

³Н-тимидин удобно использовать при изучении ДНК, так как тимидин - один из 4 нуклеозидов, участвующих при образовании полинуклеотидной структуры, который характерен только для молекулы ДНК и является ее специфическим предшественником. К числу больших достоинств ³Н-тимидина относится его доступность для тканей и быстрота включения в структуры, синтезирующие ДНК.

Принципы радиоавтографического анализа клеточного цикла были разработаны сотрудниками Брукхейвенской национальной лаборатории во главе с Квастлером (Quastler), а затем расширены и дополнены многими исследователями. Это направление в изучении регуляции клеточного цикла стало самостоятельной дисциплиной, получившей название «кинетика клеточных популяций», или, сокращенно, «клеточная кинетика».

При введении в организм ³Н-тимидина в любой популяции клеток мечеными оказываются лишь те клетки, которые в данный момент синтезируют ДНК, то есть находятся в S-периоде клеточного цикла. Клетки, находящиеся в момент введения меченого предшественника ДНК в периодах G₁ и G₂, а также в митозе, соответственно не содержат метки. ³Н-тимидин добавляют в среду клеток культуры импульсно, то есть на небольшой период времени (10-15 мин.). После этого меченый нуклеозид отмывают. В течение некоторого времени после инъекции в митоз продолжают вступать немеченые клетки, которые в момент введения меченого предшественника находились в периоде G₂. Затем в митоз начинают вступать меченые клетки, причем первыми входят те клетки, которые были помечены в конце S-периода, а последними – те, которые были помечены в его начале; именно это обуславливает разное количество зерен над различными клетками. Позже в митоз начинают вступать немеченые клетки из периода G₁. Клетки, находящиеся в период действия ³Н-тимидина в G₁, G₂-фазах или в митозе, метки содержать не будут.

Расчет пролиферативного пула.

Квастлером были предложены уравнения, позволяющие определять продолжительность периодов митотического цикла в клеточных системах, находящихся в так называемом стационарном состоянии. В таких системах число клеток, поступающих за единицу времени в любой период цикла, равно числу клеток, выходящих из этого периода, а отношение числа клеток n_i в каком-либо периоде цикла к средней продолжительности этого периода t_i есть величина постоянная и равная отношению общего числа клеток N в митотическом цикле к его длительности T:

n_i/t_i=const=N/T.

Пользуясь этим уравнением, можно вычислить продолжительность любого периода цикла, в том числе и S-периода (t_S):

t_S =( n_S · T )/ N

Т – длительность клеточного цикла – для культуры СПЭВ составляет приблизительно 20 часов.

Величины N и n_S можно рассчитать, используя метод радиоавтографии. Для этого в 10 полях зрения определяем общее число меченых клеток (n_S) и общее число клеток (все клетки в поле зрения, включая меченые – N).

Определение содержания меченых элементов или структур – уникальная особенность метода радиоавтографии. К меченым относятся клетки независимо от количества зерен серебра над ними, но, конечно, при условии, что это количество выше фона.

Таким образом, пролиферативный пул – совокупность клеток, находящихся в состоянии клеточного цикла.

2. Включение ³НУ в клетки культуры СПЭВ.

³Н-уридин обычно используется как меченый предшественник РНК. Следует заметить, что он не обладает такой избирательностью включения в РНК, как ³Н-тимидин в ДНК. Уридин, превращаясь в дезоксиуридин, может подвергаться метилированию и включаться в ДНК в виде дезокситимидина.

Для получения препарата ³Н-уридин вводили в среду на 15 мин., то есть импульсно. Для проведения радиоавтографии культуру выращивают в чашках Петри на порезанных покровных стеклышках. Далее культуру «отмывали» от ³Н-уридина. Фиксацию проводили через определенное количество времени. Первая фиксация (из чашки Петри вынимается 1-2 предметных стеклышка) была через 15 минут после удаления метки из культуральной среды. На таких препаратах метка в основном выявляется над ядрышком. Вторая фиксация (из той же чашки Петри вынимают еще 1-2 стеклышка) – через 1 час после «отмывания» метки; метка в основном локализуется в ядре. Третью фиксацию проводит через 2 часа; метка «переходит» в цитоплазму.

Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 276; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!