Транспорт через ядерную пору.
Ядерно-цитоплазматический транспорт (или же нуклеоцитоплазматический транспорт) можно разделить на активный и пассивный. Пассивный транспорт протекает за счет диффузии веществ через ядерные поры. Активный транспорт субстратов - специфический процесс, требующий энергетических затрат. Для достижения этой субстрат-специфичности ядерно-цитоплазматического транспорта существуют селективные белковые рецепторы, называемые транспортинами. Эти белки иногда делят соответственно их роли в транспорте на импортины и экспортины. Импортины переносят субстраты из цитоплазмы в ядро, а экспортины - в обратном направлении.
Установлено, что ионы и молекулы размером меньше 9 нм и молекулярным весом менее 60кДа перемещаются через ядерную пору путем пассивной диффузии через узкие каналы (зазоры) между индивидуальными компонентами поры. Транспорт остальных молекул через ЯПК является активным (регулируемым) и требует во многих случаях энергетических затрат. Внутрь ядра активно импортируются ядерные, рибосомальные и сплайсосомные белки, а из ядра активно экспортируются мРНК, тРНК, сплайсосомная РНК и пре-рибосомы. Кроме того, между ядром и цитоплазмой через пору постоянно транспортируются так называемые “шатлинг”-белки (факторы регуляции транспорта; от англ. shuttle – двигаться взад и вперед, курсировать), связывающиеся с транспортируемыми молекулами и нуклеопоринами и обеспечивающими точное и направленное прохождение молекул через отдельные компоненты поры. И, наконец, через эндоплазматический ретикулум, мембраны которого прямо соединяются с наружной мембраной ядерной поры, осуществляется транспорт интегральных мембранных белков и, в частности, белков ламины.
Активный транспорт субстрата из цитоплазмы в ядро или обратно можно в самых общих чертах представить следующим образом. Сначала в донорном компартменте (то есть том, откуда субстрат транспортируется) происходит образование комплекса груз/транспортины. Затем этот комплекс заякоривается на белках ядерной поры и транслоцируется через нее в акцепторный компартмент (то есть в тот, куда происходит транспорт). На следующей стадии комплекс диссоциирует, а груз высвобождается. Наконец, транспортины, принимавшие участие в образовании комплекса, ретранспортируются в донорный компартмент. За некоторыми исключениями, источником энергии для активного ядерно-цитоплазматического транспорта служит гидролиз GTP GTP-азой Ran , осуществляемый в ходе так называемого Ran-цикла.
Разные субстраты могут импортироваться в ядро и экспортироваться из него разными способами и при участии разных транспортинов. Но не следует думать, что эти пути транспорта абсолютно независимы друг от друга. Во-первых, большая их часть использует систему Ran-цикла как энергетический ресурс. Во-вторых, некоторые транспортины, например, такие как импортин-бета, могут принимать участие в транспорте нескольких субстратов.
Регуляция транспорта молекул через ядерную пору.
Поскольку активный транспорт молекул между ядром и цитоплазмой, осуществляемый ЯПК, является жизненно важным для обеспечения различных внутриклеточных процессов, то он контролируется многими факторами. Они включают в себя 3 взаимодействующих между собой системы: 1) комплекс биохимических регуляторов, находящихся в ядре или в цитоплазме и связывающихся с сигнальными последовательностями транспортируемой молекулы и белками ядерной поры; 2) комплекс нуклеопоринов, формирующих ЯПК и способных взаимодействовать друг с другом и биохимическими регуляторами, и 3) структурный комплекс поры, состоящий из набора индивидуальных компонентов, специфически меняющих пространственную организацию в процессе транспорта молекул и обеспечивающих, таким образом, их более эффективный перенос в нужном направлении. Рассмотрим коротко, как регулируется транспорт этими тремя системами.
Первая система .
Биохимические регуляторы насчитывают 5 основных типов белков, участвующих, как в импорте, так и в экспорте молекул: 1) транспортины (импортин a, импортин b и ряд других факторов); 2) Ran-белок (гуанозинтрифосфатаза), 3) ГТФ (гуанозинтрифосфат), 4) белок р10, а также 5) набор дополнительных белков, обеспечивающих активацию, ингибирование или изменение структурной конформации перечисленных выше белков, а также их транспорт между ядром и цитоплазмой. Функциональная роль каждого из перечисленных регуляторов была установлена в исследованиях, проведенных либо в системе in vitro (с использованием экстрактов из ооцитов амфибий), либо in vivo (преимущественно в экспериментах с дрожжевыми клетками).
Транспортины играют роль рецепторных белков, которые через белки-посредники (адапторные белки) или напрямую связываются с сигнальными участками транспортируемой молекулы. Ran -это белок, который способен утилизировать энергию ГТФ. Он может иметь два состояния: связан либо с ГТФ (Ran-ГТФ) либо с ГДФ (Ran-ГДФ). Ran плохо гидролизует ГТФ, и для изменения его состояния необходимы дополнительные белки, находящиеся в ядре (RCCI) и в цитоплазме (RanGAP1, RanBP1, и RanBP2). Обе формы Ran присутствуют и в ядре и в цитоплазме, однако концентрация Ran-ГТФ выше в ядре, в то время как Ran-ГДФ обнаруживается преимущественно в цитоплазме.
Предполагается, что белок р10 регулирует доступ транспортируемых комплексов в центральный канал поры со стороны цитоплазмы, возможно за счет его взаимодействия с нуклеопоринами, формирующими периферические компоненты поры (запирающая гранула транспортера, внутренние филаменты и другие). Однако основная функция этого белка заключается в том, что он способен связываться с Ran белком (в различных его формах) и транспортировать его в ядро или в цитоплазму.
Процесс импорта молекул в ядро изучен в настоящее время более подробно, чем их экспорт. Первым требованием к транспортируемой молекуле является наличие в ее структуре сигнальной последовательности. Предполагается, что процесс импорта белка в ядро включает в себя несколько последовательных этапов: сначала импортин b связывается с импортином a, который затем напрямую или через адапторные белки узнает сигнальную последовательность в транспортируемой молекуле и связывается с ней. Этот тройной комплекс, благодаря взаимодействию импортина b с одним из периферических нуклеопоринов, закрепляется на периферическом компоненте поры, возможно, на цитоплазматической фибрилле. Параллельно с этим Ran -белок связывается в цитоплазме с ГТФ, после чего этот комплекс также закрепляется на цитоплазматической фибрилле, благодаря взаимодействию Ran -белка с нуклеопорином, недалеко от первого комплекса. Все эти процессы происходят без потребления энергии.
Затем два комплекса взаимодействуют между собой и белком р10, обеспечивающим подготовку периферического отдела центрального канала для транспорта (предполагается, что р10 может открывать вход в центральный канал поры со стороны цитоплазмы). При этом происходит гидролиз ГТФ, и весь сформированный комплекс перемещается с цитоплазматической фибриллы в центральную часть поры и далее транспортируется внутрь ядра. Цитоплазматический вход в центральный канал поры после этого закрывается, а переместившийся в ядро комплекс отделяется от перенесенной молекулы и распадается на димер, состоящий из импортинов a и b, и Ran -ГДФ. Последний комплекс с помощью специфического фактора опять переводится в Ran -ГТФ, который затем разъединяет импортин a и импортин b.
В последнее время появились данные о том, что многие молекулы могут импортироваться в ядро без участия Ran и, соответственно, без потребления энергии. При этом соответствующие транспортины и адапторные белки связываются в цитоплазме с импортируемым субстратом, и этот комплекс проходит через ядерную пору в ядро. В ядре транспортные факторы этого комплекса взаимодействуют с Ran-ГТФ, что приводит к высвобождению импортированного субстрата за счет превращения Ran-ГТФ в Ran-ГДФ. Затем транспортные факторы опять связываются с Ran-ГТФ и этот комплекс возвращается в цитоплазму.
Предполагается, что многие из перечисленных выше биохимических факторов могут принимать участие в регуляции не только импорта, но и экспорта белков, а также РНК из ядра в цитоплазму. Однако процесс экспорта мРНК из ядра является более сложным по сравнению с импортом или экспортом белков, поскольку находится под контролем многих дополнительных факторов, включающих различные РНК-связывающие белки. Так, например, показано, что при экспорте мРНК из ядра она направляется в центральный канал поры 5’-концом, и важную роль в этом процессе, вероятно, играют кэп-связывающие белки, находящиеся на 5’-конце мРНК. Показано также, что для каждого класса РНК (мРНК, тРНК, рРНК, сплайсосомных РНК) существуют свои специфические белки-переносчики, одни из которых отсоединяются от РНК в процессе ее транспорта через пору и остаются в ядре, в то время как другие сопровождают молекулу РНК в цитоплазму.
При экспорте молекул Ran-ГТФ образует комплекс с транспортинами, соответствующими адапторными белками и экспортируемым субстратом. Весь этот сложный комплекс проходит через пору в цитоплазму. Здесь цитоплазматические факторы RanGAP1, RanBP1, и RanBP2 стимулируют гидролиз ГТФ, что вызывает распад транспортированного комплекса с высвобождением Ran-ГДФ. То есть выделяющаяся при этом энергия используется для освобождения транспортируемых молекул от их переносчиков. Белок р10, который за счет небольших размеров (м.в. 10кДа) может свободно диффундировать между ядром и цитоплазмой, связывается в цитоплазме с Ran-ГДФ и транспортирует его в ядро. В ядре находится связанный с хроматином фактор RCCI, который вызывает высвобождение ГДФ и переход Ran в ГТФ-связанную форму. Процесс циркуляции Ran между ядром и цитоплазмой носит название ГТФ-азного цикла Ran. Таким образом, можно предположить, что градиент концентрации Ran, постоянно поддерживаемый между ядром и цитоплазмой, представляет механизм, определяющий направленность транспорта.
Вторая система .
Из 50 предполагаемых нуклеопоринов (Nup), входящих в состав ядерной поры высших эукариот, в настоящее время описано около 40 белков, 25 из которых уже секвенированы. Практически все белки ядерной поры охарактеризованы дрожжей (30 белков), а экспериментальные данные, полученные на высших организмах, являются малочисленными. Распределение многих нуклеопоринов на различных структурных компонентах поры было изучено иммуногистохимически с использованием антител к этим белкам.
Установлено, что белки ЯПК можно условно разделить на 3 группы: первая содержит в своем составе белки со специфическими повторяющимися последовательностями (типа FXFG и др.), которые узнаются биохимическими факторами; вторая содержит белки, не имеющие таких последовательностей, а третья включает так называемые интегральные белки, локализующиеся либо в мембране ядерной оболочки, формирующей пору, либо в участке поры, находящемся в просвете между ядерными мембранами. Сравнительный анализ нуклеопоринов у высших и низших эукариот показал наличие 30-50% гомологии для 4 пар белков: Nup62/Nsp1p; Nup107/Nup84; Nup155/Nup170; Nup98/Nup116 (первыми в парах указаны белки высших, вторыми - белки низших эукариот; названия белков приводятся согласно общепринятой в литературе классификации). В последнее время было установлено, что нуклеопорины могут образовывать сложные комплексы, состоящие из 5-7 белков, что, вероятно, отражает их участие в формировании индивидуальных компонентов поры. Некоторые из нуклеопоринов, такие, как Nup188, Nup170, Nup157, Nic 96, POM152 составляют до 25% массы ядерных пор и присутствуют в 10-20 копиях на одну пору.
Получены доказательства того, что нуклеопорины принимают непосредственное участие в регуляции транспорта молекул через ЯПК. Благодаря их взаимному контакту, а также взаимодействию с биохимическими факторами, несущими транспортируемую молекулу, они могут обеспечивать ее последовательную передачу, подобно эстафетной палочке, из одного участка ядерной поры в другой. Некоторые из нуклеопоринов могут, очевидно, напрямую связываться с транспортируемой молекулой. Так, например, Nup153 и Nup98, входящие в состав баскет-фибрилл, содержат РНК-связывающие домены, а Nup358 и CAN/Nup214, располагающиеся на цитоплазматических фибриллах поры, узнают сигнальные последовательности некоторых белков. Транспорт молекул через центральные компоненты поры находится под контролем белка Nup62, который является самым представительным и распределен вдоль всего центрального канала.
Третья система .
Использование высокоразрешающего сканирующего электронного микроскопа позволило впервые зафиксировать конформационные изменения индивидуальных компонентов ЯПК в процессе молекулярного транспорта. Было показано, что экспорт гигантской мРНК, синтезируемой генами колец Бальбиани у хирономуса, сопровождается циклической реорганизацией баскета и транспортера, функционирующих, как система открывающихся и закрывающихся диафрагм.
Согласно наблюдениям, сделанным нами в сканирующем электронном микроскопе, в неактивной поре оба входа в центральный канал поры закрыты периферическими гранулами транспортера. Кроме того, вход в пору со стороны ядра дополнительно закрыт фибриллами баскета. На первом этапе экспорта молекула РНК, упакованная в процессе транскрипции с белками в 50 нм РНП частицу, перемещается внутри ядра к поре и прикрепляется к верхушке баскета. Предполагается, что Nup153 и Nup98, входящие в состав баскета, принимают активное участие в этом событии. Баскет-фибриллы формируют увеличивающееся в размере кольцо, которое постепенно захватывает частицу, и она погружается внутрь баскета. Поскольку максимальный диаметр центрального канала ЯПК составляет всего 26 нм, РНП частица внутри баскета декомпактизуется в 26 нм фибриллу. Было также обнаружено, что РНП частица вращается внутри баскета, что, вероятно, связано с необходимостью ее транспортировки в пору 5’-концом. Таким образом, баскет структура выполняет как бы роль “таможни”, проверяя и подготавливая молекулу РНП к транспорту через пору.
На следующем этапе в периферической грануле транспортера со стороны ядра открывается отверстие и РНП фибрилла начинает перемещаться внутрь поры. Внутренний диаметр центральных цилиндров транспортера, имевший до этого размер 10 нм, расширяется до 26 нм, и фибрилла транспортируется через них дальше, в сторону цитоплазмы. Периферическая гранула транспортера со стороны цитоплазмы также формирует отверстие диаметром 26 нм, и РНП фибрилла постепенно полностью выходит в цитоплазму, где начинается процесс трансляции. После окончания транспорта все компоненты ЯПК быстро возвращаются в исходное состояние. Было установлено, что в процессе транспорта периферические гранулы транспортера могут перемещаться в вертикальном направлении на 5 нм, а сама пора - уплощаться или вытягиваться, способствуя, таким образом, более эффективному перемещению транспортируемой молекулы. Все эти данные свидетельствуют о том, что ЯПК является очень пластичной и динамичной структурой, непосредственно участвующей в регуляции транспорта. Вместе с тем следует отметить, что в последние годы появились данные о том, что пора может активно транспортировать до 300 и более небольших молекул в секунду. Это предполагает наличие каких-то дополнительных и пока неизвестных нам механизмов обеспечивающих такую высокую скорость перемещения молекул через пору. Поскольку пора с одной стороны тесно связана с ламиной и, следовательно, с ядерным матриксом, а с другой - через ядерную оболочку с цитоскелетом, процесс транспорта через ЯПК может также регулироваться на уровне этих внутриклеточных структур.
Импорт.
Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 1199; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!