Следует подчеркнуть, что Q- и G-методами окрашиваются одни и те же участки хромосом.

Занятие № 6 .

Клеточное ядро.

Уровни компактизации ДНК.

Митотическая хромосома.

ДНК.

1. Фракция быстро реассоциирующихся последовательностей.

ДНК обрабатывают ультразвуком. При этом она деградирует на двуцепочечные куски одинакового размера. Затем смесь денатурируют и медленно охлаждают. Комплементарные цепи ДНК, разделенные при денатурации, при определенных условиях (при температуре на 20°С ниже, чем температура плавления ДНК) могут вновь соединиться в двойную спираль. Этот процесс называется ренатурацией. Если денатурация произошла не полностью и хотя бы несколько оснований не утратили взаимодействия водородными связями, ренатурация протекает очень быстро. Наиболее часто повторяющиеся последовательности реассоциируют быстрее всего (им легче «найти» друг друга), их скорость ренатурации выше.

Реассоциация начинается с взаимодействия коротких комплементарных последовательностей нуклеотидов, время существования которых в ассоциированном состоянии может оказаться непродолжительным, если соседние участки ДНК окажутся некомплементарными. Процесс повторяется снова и снова, пока не ассоциируют "нужные" участки. Однако, как они провзаимодействуют, двойная спираль ДНК восстанавливается очень быстро. Ренатурация - двухстадийный процесс. На первом этапе должны встретиться два комплементарных участка.

К фракции быстро реассоцирующихся последовательностей относятся:

Сателлитная ДНК.

В местах расположения сателлитной ДНК возможна максимальная компактизация. В конститутивном гетерохроматине все четыре уровня упаковки ДНК представлены даже в интерфазе. Сателлитная ДНК всегда располагается тандемно по 100-200 единиц в блоке. Образуются длинные последовательности в геноме. Сателлитная ДНК обязательно располагается в центромерном районе. Это обеспечивает бесплодие возможных межвидовых гибридов. Кроме того, сателлитная ДНК всегда присутствует в области теломер.

Таким образом, на данный момент термин «сателлитная ДНК» используется в основном в отношении длинных тандемных повторов, расположенных в области теломер и центромер. Сателлитная ДНК не транскрибируется в сколько-нибудь заметных количествах и скорее всего ничего не кодирует. Сателлитная ДНК, находящаяся в области центромеры, реплицируется в S-фазе в числе последних, а в политенных хромосомах она часто оказывается недореплицированной по сравнению с другими участками.

Полиндромы.

Полиндром - это зеркальная последовательность, если взять символьную последовательность и зеркально ее отобразить, то получится полиндром. По аналогии: полиндромы - это такие фразы, которые в обе стороны читаются одинаково.

2. Фракция умеренно повторяющихся последовательностей.

Последовательности этой фракции реассоциируют позднее. От 20 до 60% ДНК входит в состав этой фракции. Все гены этой фракции являются транскрибируемыми. Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 10² до 10⁵ раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в обменных процессах. К ней относятся: рибосомные гены, гены 5S-РНК, гены тРНК, гены гистонов.

3. Фракция уникальных последовательностей.

Фракция уникальных последовательностей несет информацию для большинства белков клетки. Эта фракция составляет до 70%.

Хроматин.

Гистоны.

Главные свойства гистонов:

1) Высокоосновный характер.

2) Имеют доменную структуру. Гистоны состоят из 3 доменов: «nose» - на N-конце, «tails» - на C-конце, «head» -основная часть, образует глобулярную структуру.

3) Высокая эволюционная консервативность. Это означает, что гистоны имеют схожую структуру у всех эукариот: от дрожжей до человека. Величина единичного эволюционного периода – время, за которое последовательность аминокислот изменяется на 1%. Для гистона Н3 она равна 3х10⁸ лет, для гистона Н4 - 6х10⁸лет. Для сравнения у гемоглобина эта величина составляет 6х10⁶лет.

4) Все гистоны проходят посттрансляционную модификацию.

§ Ацетилирование происходит на 5'-конце.

§ Фосфорилирование затрагивает преимущественно N- и C-концы.

§ Убиквитинирование – к гистонам Н2А и Н2В, как правило, по лизиновому остатку присоединяется белок убиквитин. Присоединение убиквитина является сигналом на деградацию белка (то есть убиквитинирование гистонов происходит, когда клетка уходит в митоз).

5) Встречаются изоформы гистонов: по молекулярной массе, по аминокислотной последовательности, по форме. Следует обратить внимание, что ткани организмов могут отличаться по содержанию гистонов, но не по их отсутствию.

Нуклеосома.

Общая масса нуклеосомы – 262 кДа. Масса ДНК – 130кДа, гистонов Н2А и Н2В – по 28 кДа, гистонов Н3и Н4 – по 30 кДа, гистона Н1 -24 кДа

* Джон Дальтон (1766-1844) положил начало признанию атомной массы как главной характеристики элемента. В 1803 он составил первую таблицу атомных масс (отнесённых к массе атома водорода, принятой за единицу). Кстати, дальтонизм назван так потому, что впервые был замечен именно у Дальтона.

Дальтон – единица измерения молекулярной массы. Дальтон - единица измерения массы 1 атома Н: 1,67 х 10^{-24 г.}

2.3. Негистоновые белки.

Негистоновые белки – все белки хроматина (кроме гистонов), выделяющиеся с хроматином или с хромосомами.

Ø Белки ламины.

Ø SMC-белки (SMC – structural maintenance of chromosomes). Эти белки в основном не поддерживают определенную структуру хромосом (например, конденсированное состояние), а скорее создают структуры и вызывают их динамическое изменение. Белки SMC играют роль в когезии сестринских хроматид, конденсации хромосом, рекомбинации и репарации ДНК. У эукариот известно 6 членов семейства –белков. 6 классов эукариотических SMC-белков названы SMC1-SMC6 у большинства организмов; они могут сгруппированы в соответствии с 3 группами гетеродимеров, которые они формируют: SMC1 и SMC3, SMC2 и SMC4, SMC5 и SMC6. SMC-белки являются структурным компонентом когезинов и конденсинов.

§ Когезины. В состав когезина входят SMC 1-SMC 3–гетеродимер, а также не SMC –белки. Когезия (слипание) сестринских хроматид представляет собой комплексный процесс, необходимый для поддержания целостности генома во всех эукариотических организмах. Нарушения когезии в клетках человека могут приводить к различным генетическим заболеваниям. Основой молекулярного аппарата когезии является белковый комплекс когезин. Существует предположение, что когезин участвует белки в сцеплении сестринских хроматид в мейозе. Когезин связывается с хроматином со значительно большей аффинностью чем с ДНК. Связывание когезина с хроматином не зависит от хвостов коровых гистонов. Таким образом, базовой функцией когезина является обеспечение правильной сегрегации сестринских хроматид после репликации ДНК вплоть до начала деления.

§ Конденсины. Конденсин участвует в компактизации хромосом при переходе к митозу. В клетках позвоночных конденсин является в течение интерфазы цитоплазматическим белком. Конденсин является комплексом из 5 субъединиц, включающий в себя SMC2- SMC4, а также не SMC-белки.

Ø HMG-белки.

Дифференциальное окрашивание.

В конце 60-ых гг. Дарлингтон и Ла Кур, изучая растительные объекты, обнаружили, что некоторые красители (в частности квинокрин) окрашивают определенные участки хромосом. Они назвали эти участки бэндами. Каждая хромосома характеризуется специфическим комплексом полос. Гомологичные хромосомы окрашиваются идентично, за исключением полиморфных районов, где локализуются разные аллельные варианты генов. Аллельный полиморфизм характерен для многих генов и встречается в большинстве популяций. Сегментация универсальна: она присуща всем хромосомам эукариот. Характер сегментации видоспецифичен.

На данный момент разработано несколько методов дифференциального окрашивания, или бэндинга.

v G-метод. После интенсивной предварительной обработки, часто с применением трипсина (это протеаза; ферменты класса гидролаз, расщепляющие пептидные связи в белках и пептидах; то же, что протеолитические ферменты), хромосомы окрашивают красителем Гимзы. Под световым микроскопом на хромосомах видны светлые и темные полосы — G-сегменты. Хотя расположение Q-сегментов соответствует расположению G-сегментов, G-окрашивание оказалось более чувствительным и заняло место Q-окрашивания в качестве стандартного метода цитогенетического анализа. G-окрашивание дает наилучшие результаты при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы). Именно этим способом окрашены наши препараты.

В состав красителя Гимза входят: азур, метиленовый фиолетовый, метиленовый синий, эозин. Механизм окраски не ясен. Предполагается, что краситель связывается с зонами большей плотности хромосом. Название метода произошло от названия красителя – Gimza.

v Q-метод был разработан шведским цитологом Касперссоном. Для этого метода используют флуорисцентный краситель, который получил название акрихиниприт (соответственно, для анализа этого вида окрашивания используют флуорисцентный микроскоп). Акрихиниприт связывается с гуаниновыми основаниями; предполагается, что он выявляет G-С-зоны. Метод лучше всего подходит для исследования Y-хромосом и потому используется для быстрого определения генетического пола, выявления транслокаций (обменов участками). Название метода произошло от красителя квинокрина.

Следует подчеркнуть, что Q- и G-методами окрашиваются одни и те же участки хромосом.

v С-метод используют для анализа центромерных районов хромосом (эти районы содержат конститутивный гетерохроматин) и вариабельной, ярко флюоресцирующей дистальной части Y-хромосомы.

v R-метод дает картину, противоположную G-окрашиванию. Обычно также используют краситель Гимзы или флюоресцентный краситель акридиновый оранжевый. Этим методом выявляют различия в окрашивании гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

v Т-метод применяют для анализателомерных районов хромосом. Эту методику, а также окрашивание районов ядрышковых организаторов азотнокислым серебром (AgNOR-окрашивание) используют для уточнения результатов, полученных путем стандартного окрашивания хромосом.

Следует отметить, что в 1971г. на Парижской конференции была предложена классификация методов дифференциальной окраски. Методы, с помощью которых выявляется сегментация хромосом, можно подразделить на 6 основных классов: Q-, G-, R-, T-, C-окраски и окраска по Фельгену. Кроме того, позднее были разработаны методики дифференциального переваривания хромосом энзимами, а также флуорисцентная гибридизации in situ (FISH).

Митотическая хромосома.

Еще в 1882 г. Э. Страусбургером было обнаружено у растения Funkia sieboldiana, что хромосомы одной и той же ядерной пластинки весьма резко различаются по величине. В 1912г. К.Мюллер посвятил целое исследование варьированию размеров хромосом. Точным установлением того факта, что каждой хромосоме присущи, помимо определенного абсолютного (или относительного) размера, еще и постоянные и характерные особенности в построении их тела, наука обязана трудам Сергея Гавриловича Навашина (1857-1930), выполненным в 1910-1914гг.

Уже в ранних работах Навашин выделяет три типа хромосом: 1) U-образные, почти равноплечие; 2) U-образные, явственно неравноплечие; 3) крючковидные, один членик которых настолько короток, что даже может ускользнуть из наблюдения. В 1912г. Навашин установил наличие особых мельчайших, но вполне постоянных придатков, присоединенный при помощи «ниточки» в 2 «средним» хромосомам. Придатки эти были названы Навашиным «спутниками». Спутники при делении ядра расщепляются вместе с остальным телом хромосомы. Таким образом, впервые была показана возможность идентификации хромосом по особенностям их строения.

Фактически в соответствии с классификацией Навашина выделяют 4 типа хромосом зависимости от положения центромеры и определяемой этим положением относительной длины плеч, т.е. частей хромосомы по обе стороны от центромеры. По мнению многих ученых любая хромосома имеет два плеча, т.е. телоцентрической хромосомы в природе не существует. У телоцентрических хромосом во всех случаях обнаружено наличие второго, пусть очень короткого плеча. Кроме того, современные данные свидетельствуют о том, что на каждой конце хромосомы должна быть теломера с некоторым количеством прителомерного гетерохроматина. Таким образом центромера не может находиться на самом конце хромосомы.

Препараты и микрофотографии.

Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 190; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

12 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!