Физиологические и патологические процессы, сопровождаемые апоптозом.
Занятие № 14.
Гибель клетки. Некроз и апоптоз.
Клеточная смерть известна с момента открытия самой клетки, еще с 1665 г.: Р. Гук (R. Hooke) описал формации коры дуба из погибших клеток. Однако долгое время это наблюдение оставалось без внимания. Первые гистологические описания клеточной смерти опубликовали К.Фогт (C.Vogt) в 1842 г. и Р. Вирхов (R.Virchow) в 1859 г.
Смерть клетки — постоянное проявление жизнедеятельности организма и в здоровом состоянии оно сбалансировано физиологической регенерацией клеток. Как структурные компоненты клеток, так и целые клетки изнашиваются, стареют, гибнут и требуют замены. Поддержание различных органов и тканей в здоровом состоянии невозможно без “естественного” физиологического обновления, а, следовательно, без смерти отдельных клеток. Такая смерть клеток получила в 1972 году название “апоптоз” (Kerr et al.,1972). Но смерть клетки может происходить в живом организме в результате “насильственных” действий внешних повреждающих (патогенных) факторов. Такая смерть клетки носит название “некроз”. Мертвые клетки полностью прекращают свое функционирование. Гибель клетки сопровождается необратимыми биохимическими и структурными изменениями. Таким образом, смерть клетки может происходить двумя путями: некроза и апоптоза.
Некроз.
В настоящее время существует две противоположные точки зрения на некроз. Согласно одной точке зрения, некроз (от греч. nekros — мертвый) – это смерть, гибель части живого организма, необратимое прекращение жизнедеятельности его элементов. Согласно другой – некроз – это не смерть, а уже посмертные изменения погибшей клетки. В настоящем описании мы будем придерживаться первой точки зрения.
|
|
|
Морфогенез некроза.
Некрозу могут подвергаться часть клетки, клетка, группы клеток, участок ткани, целый орган или часть тела. Согласно А.И. Струкову и В.В. Серову (1995) некротический процесс проходит ряд стадий, что позволяет говорить о морфогенезе некроза:
Ø паранекроз – подобные некротическим, но обратимые изменения;
Ø некробиоз – необратимые дистрофические изменения, характеризующиеся преобладанием катаболических реакций над анаболическими;
Ø смерть клетки, время наступления которой установить трудно;
Ø аутолиз – разложение мертвого субстрата под действием гидролитических ферментов погибших клеток и макрофагов.
В морфологическом выражении некроз равнозначен аутолизу.
Причины некроза.
— физические (огнестрельное ранение, радиация, электричество, низкие и высокие температуры - отморожение и ожог);
— токсические (кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, ферменты, лекарственные препараты, этиловый спирт и др.);
|
|
|
— биологические (бактерии, вирусы, простейшие и др.);
— аллергические (эндо- и экзоантигены, например, фибриноидный некроз при инфекционно-аллергических и аутоиммунных заболеваниях, феномен Артюса);
— сосудистый (инфаркт - сосудистый некроз);
— трофоневротический (пролежни, незаживающие язвы).
1.3. В зависимости от механизма действия патогенного фактора различают:
— прямой некроз, обусловленный непосредственным действием фактора (травматические, токсические и биологические некрозы),
— непрямой некроз, возникающий опосредованно через сосудистую и нервно-эндокринную системы (аллергические, сосудистые и трофоневротические некрозы).
Морфологические признаки некроза.
Ранние изменения: В начальном периоде некробиоза клетка морфологически не изменена. Должно пройти 1-3 часа, прежде чем появятся изменения, распознаваемые при электронной микроскопии или гистохимически, и, по крайней мере, 6-8 часов, прежде чем появятся изменения, выявляемые при световой микроскопии; еще позже развиваются макроскопические изменения. Например, если больной с инфарктом миокарда умирает спустя несколько минут от момента начала приступа стенокардии (боль при недостаточном притоке крови к миокарду), то на аутопсии не будет выявлено никакого структурного свидетельства некроза; если же смерть наступает на 2-й день после острого приступа, то изменения будут очевидны.
|
|
|
Гистохимические изменения: приток ионов кальция в клетку тесно связан с необратимым повреждением и появлением морфологических проявлений некроза. В нормальной клетке внутриклеточная концентрация кальция составляет приблизительно 0.001 от концентрации его во внеклеточной жидкости. Этот градиент поддерживается мембраной клетки, которая активно транспортирует ионы кальция из клетки. Экспериментально доказано, что при повреждении клеток в результате ишемии или под воздействием различных токсических агентов, накопление кальция внутри клеток наблюдается только тогда, когда изменения необратимы. Кальций активирует эндонуклеазы (гидролиз, расщепление ДНК), фосфолипазы (разрушение мембран) и протеазы (деструкция, переваривание цитоскелета). Повышение их активности выявляется гистохимическими методами. Активность окислительно-восстановительных ферментов (например, сукцинатдегидрогеназы) резко падает или исчезает.
|
|
|
Изменения в ядрах: изменения в ядрах — самое лучшее свидетельство некроза клетки. Хроматин мертвой клетки конденсируется в крупные глыбки и ядро становится уменьшенным в объеме, сморщенным, плотным, интенсивно базофильным, то есть окрашивается в темно-синий цвет гематоксилином. Этот процесс назван пикнозом (характеризуется уплотнением и сморщиванием ядер, конденсацией хроматина). Пикнотическое ядро может затем разрываться на многочисленные маленькие базофильные частицы (кариорексис) или подвергнуться лизису (растворению) в результате действия лизосомальной дезоксирибонуклеазы (кариолизис). Тогда оно увеличивается в объеме, слабо окрашивается гематоксилином, постепенно теряются контуры ядра. При быстро развивающемся некрозе ядро подвергается лизису без пикнотической стадии.
Цитоплазматические изменения: приблизительно через 6 часов после того, как клетка подверглась некрозу, цитоплазма ее становится гомогенной и ацидофильной, то есть окрашивается интенсивно кислыми красителями, например, в розовый цвет при окраске эозином. Это- первое изменение, выявляемое световой микроскопией, которое возникает в результате коагуляции цитоплазматических белков и разрушения (исчезновения) рибосом. РНК рибосом придает базофильный оттенок нормальной цитоплазме. Специализированные органеллы клетки, например, миофибриллы в миокардиальных клетках, исчезают в первую очередь. Набухание митохондрий и деструкция (разрушение) мембран органелл вызывают вакуолизацию цитоплазмы. Наконец, переваривание клетки ферментами, которые высвобождаются из собственных лизосом, вызывает лизис клетки (аутолиз). Таким образом, в цитоплазме происходит коагуляция белков, сменяемая обычно их колликвацией.
Изменения межклеточного вещества охватывают как межуточное вещество, так и волокнистые структуры. Чаще всего развиваются изменения, характерные для фибриноидного некроза: коллагеновые, эластические и ретикулиновые волокна превращаются в плотные, гомогенные розовые, иногда базофильные массы, которые могут подвергаться фрагментации, глыбчатому распаду либо лизироваться. Реже может наблюдаться отек, лизис и ослизнение волокнистых структур, что свойственно колликвационному некрозу.
Таким образом, некроз – вид гибели клетки, характеризующийся:
функционально – необратимым прекращением ее жизнедеятельности;
морфологически – нарушением целостности мембран, изменением ядра (пикноз, рексис, лизис), цитоплазмы (отек), разрушением клетки;
биохимически – нарушением выработки энергии, коагуляцией, гидролитическим расщеплением белков, нуклеиновых кислот, липидов;
генетически – потерей генетической информации; и завершающийся ее аутолизом или гетеролизом с воспалительной реакцией.
Интересно отметить, что симптомы воспаления были сформулированы еще А.К.Цельсом (A.C.Celsus) – это "rubor, calor, tumor et dolor" (покраснение, жар, опухание и боль). Галанкин и Токмаков сравнивают воспаление с военными действиями на уровне государств: "В мирное время государство… живет в условиях сбалансированной экономики… Его военный потенциал достаточен для выполнения доктрины разумного сдерживания потенциального противника… Но вот… возникает военный конфликт. Цель освобождения территории от неприятеля достигается … не без потерь: экономика перестраивается…, взрываются коммуникации и трубопроводы, разрушаются жилища и мосты, рвутся линии электропередач, при отступлении применяется тактика выжженной земли… Предположим, армия наступает. Далеко не каждая пуля, выпущенная бегущей пехотой, точно попадает в цель, в спешке моторизованные части могут перевернуть понтон, оглушенный телефонист может неправильно понять приказ, авиация – выбросить бомбу на собственную автоколонну и т.д.".
Апоптоз.
В ходе эволюции у клеток многоклеточных организмов возникли механизмы самоуничтожения – программированной клеточной смерти (ПКС). Эти механизмы координируются на генетическом уровне и контролируются как внешними, так и внутренними факторами. Одним из видов ПКС является апоптоз (апоптоз не должен рассматриваться как синоним программируемой гибели клеток). Термин апоптоз был предложен Уайли и соавторами в 1980г. Название «апоптоз» произошло от греч. απο – от, πτοξ – падение: авторы сравнивали это с опаданием листьев на деревьях (первые стадии апоптоза).
Физиологические и патологические процессы, сопровождаемые апоптозом.
Апоптоз сопровождает организм в течение всей его жизни, наряду с пролиферацией и дифференцировкой.
Физиологические процессы, сопровождаемые апоптозом:
§ тканевый гомеостаз - необходимая физиологическая гибель клеток в процессе онтогенеза: путем апоптоза погибают нейтрофилы, клетки эпидермиса кожи, энтероциты и т.п.;
§ эмбриогенез и морфогенез: исчезновение перепонки между пальцами в эмбриогенезе, формирование полостей у эмбрионов;элиминация (от лат. elimino - выношу за порог, удаляю) – удаление, устранение; например метаморфоз головастика, формирование половых органов в эмбриогенезе;контроль числа клеток в онтогенезе; так например, клетки нейроглии образуются в бóльшем количестве – около 50% их разрушается;
§ прекращение иммунного ответа – путем апоптоза погибают Т- и В-лимфоциты.
Патологические процессы, сопровождаемые апоптозом:
А. Подавление апоптоза.
§ Неоплазия. Для большинства опухолей (лимфомы, карциномы, гормонзависимые опухоли) характерно подавление процессов гибели клетки путем апоптоза.
§ Некоторые вирусные инфекции
Б. Стимуляция апоптоза.
§ СПИД. ВИЧ способствует апоптозу в Т-лимфоцитах, тем самым ослабляя иммунную систему.
§ Нейродегенеративные заболевания. Так например, при болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона происходит гибель нейронов путем апоптоза.
§ Атеросклероз. Гладкомышечные клетки погибают путем апоптоза.
Морфология апоптоза.
v На светооптическом уровне.
В начальной фазе апоптоза отмечается уплотнение ядерного хроматина. Затем ядерный хроматин конденсируется в виде крупных глыбок преимущественно около ядерной мембраны, а после ее разрушения свободно располагается в цитоплазме.
При дальнейшем развитии апоптоза цитоплазма клетки уплотняется и становится более эозинофильной по сравнению с цитоплазмой окружающих клеток. Ядро разделяется на несколько фрагментов. Такая клетка теряет контакт с соседними клетками.
На последних стадиях происходит формирование апоптических телец. Апоптические тельца образуются в результате фрагментации клетки на отдельные части. Они состоят преимущественно из остатков цитоплазмы без ядерного компонента или содержат фрагменты ядра. Апоптические тельца поглощаются макрофагами или соседними клетками данной ткани; последнее хорошо видно в электронный микроскоп.
v На электронно-микроскопическом уровне.
При электронно-микроскопическом исследовании выделяют 4 последовательные стадии в развитии апоптоза:
Ø Первая стадия. Агрегация ядерного хроматина в виде крупных глыбок, располагающихся вдоль ядерной мембраны. Контуры ядра становятся извитыми, ядро приобретает неправильную форму. Ядрышко увеличивается в размере. Ядерные поры определить трудно. Впоследствии ядро разделяется на несколько фрагментов, содержащих глыбки конденсированного хроматина. На поверхности клетки формируются выпячивания цитоплазмы. Конденсация цитоплазмы приводит к уплотнению ее органелл. Уплотнение цитоплазмы часто сопровождается появлении полупрозрачных вакуолей.
Ø Вторая стадия характеризуется образованием ограниченных м5ембраной апоптических телец. Количество, состав размер телец могут варьировать.
Ø Третья стадия характеризуется фагоцитированием апоптических телец. Следует подчеркнуть, что в «переваривании» апоптических телец участвуют ферменты лизосом фагоцитов, а не самих погибающих клеток.
Ø Четвертую стадию характеризует наличие остаточных телец.
Стадии апоптоза.
Фаза экзекуции внеядерная.
Фаза экзекуции является активной фазой апоптоза, происходящей немедленно после того, как в клетке включается программа самоуничтожения. Она длится около часа и характеризуется яркими морфологическими проявлениями апоптоза (т.е. блеббингом мембраны, конденсацией хроматина и фрагментацией ДНК). Кульминацией является разрушение клетки и упаковка ее для фагоцитоза. Большинство исследований фазы экзекуции фокусировалось на выяснении ядерных изменений с идентификацией механизмов, ответственных за ядерную экзекуцию - таких как связь между выделением цитохрома С, активацией каспазы 9/3 и фрагментацией ДНК.
Изучение цитоплазматических или внеядерных явлений задерживалось. Однако в течение конца 90-х гг понимание соответствующих механизмов и биохимических процессов привело к значительному росту интереса по отношению к явлениям, происходящим вне ядра в процессе фазы экзекуции. Несмотря на возникший интерес к внеядерной фазе экзекуции, на первый взгляд разные исследования кажутся относительно разрозненными. Однако если разделить фазу экзекуции на три последовательные фазы, почти все данные, полученные по явлениям внеядерной фазы экзекуции могут быть описаны в относительно логичной схеме.
Первой стадией является высвобождение (release). При вхождении большинства клеток в фазу экзекуции, они высвобождают прикрепления внеклеточного матрикса (ЕСМ) и реорганизуют фокальную адгезию (FA), приобретая более округленную морфологию. Эти наружные изменения коррелируют с потерей стрессфибрилл (если таковые имеются) и реорганизацией актина в переферийные (кортикальные) связанные с мембраной кольцевые пучки. Разборка микротрубочек также происходит на этой стадии.
Вторая стадия - стадия блеббинга начинается с сокращения актинового кольца связанного с миозином II с последующим периодом продолжительного впячивания и выпячивания плазменной мембраны. Это продолжается до тех пор, пока клетка не входит в стадию конденсации.
Третия стадия конденсации характеризуется трансформацией клетки в маленькие апоптические тела или в одиночный сжатый шарик, коррелируя с растворением полимеризованного актина.
Фаза высвобождения.
Первая фаза в большинстве клеток претерпевающих апоптоз состоит в откреплении ЕСМ (внеклеточного матрикса) и округлении. Процесс наиболее драматично выражен в распластанных клетках, которые обладают четкими прикреплениями матрикса и наличием стрессфибрилл, таких как фибробласты, эпителиальные и эндотелиальные клетки. Процесс наименее ярко выражен в клетках со слабыми прикреплениями матрикса, таких как лимфоциты. Фаза высвобождения была частично понята в эндотелиальных клетках, где сильные периферийно-латеральные FA комплексы (фокальной адгезии) разбираются одновременно с реконструкцией фокальных контактов прямо под округлившейся клеткой. Одновременно, актин перестраивается в форме периферийного кольца в преддверии блеббинга.
Ингибирование полимеризации актина при помощи малых концентраций цитохалазина D поддерживает распластанное состояние при наличии стимулов к апоптозу, что заставляет предположить, что реорганизация актина является существенным моментом. Акойния (апоптоз, обусловленный откреплением матрикса) представляет прямое вхождение в стадию высвобождения. В акойнийных клетках передача сигнала при помощи FA киназы фокальной адгезии разрушена, что приводит к изменениям в различных цепях передачи ключевых сигналов.
Белки фокальной адгезии. Внутриклеточно белок FAK прикреплен, как и три других структурных FA протеина (альфа-актинин, талин и белок pBo-CAS), которые привязывают актин к фокальным точкам адгезии. Пансиллин, еще один структурный FA протеин, дефосфорилирован и диссоциируется от FA
Актиновые регуляторы. Hsp27 , который участвует в реорганизации актина, является важным фактором в перестройке актина при апоптозе эндотелиальных клеток. Гельзолин также вовлечен в этой фазе, как следует из исследований с гельзолин -/- клетками, демонстрирующими значительную задержку в наступлении блеббинга, хотя, в конце концов, он происходит.
Микротрубочки. Разборка микротрубочек (МТ) происходит на ранней стадии фазы экзекуции и может быть необходима для округления клеток. Помимо прерывания внутриклеточного транспорта, разборка МТ нарушает организацию клетки и высвобождает большое число регуляторных белков, которые в норме привязаны к МТ.
Эффекторы. На фазе высвобождения существенную роль играют каспазы, поскольку если каспазы заингибированы, то во многих клеточных типах морфологические изменения не начинаются (однако это может происходить преимущественно в системах, где сигнальная передача апоптозных стимулов требует наличия каспаз в верхней части цепи). Каспазы связывают FA белки, включая FAK и p130CAS. Однако клетки многих типов сокращаются и/или начинают блеббинг невзирая на ингибицию каспаз.
Калпаины (Calpains), которые связывают альфа-актинин, фодрин и талин (структурные протеины, связывающие актин и плазменную мембрану) также задействованы в фазе высвобождения.
Киназы. Сигнальные воздействия p38MAP-киназы активируют hsp27 и реорганизацию актина. В анойкии MEKK-1, верхний регулятор p38MAP-киназы активируется каспазами и в свою очередь может играть роль в активации каспазы-7. Эта потенциально положительная цепочка обратной связи может объяснить, почему вхождение в фазу экзекуции является повидимому необратмым. p21 киназа 2 (PAK2), активируется малыми GTPазами Pac и Cdc42 и про нее известно, что она реорганизует актиновый цитоскелет, она переводится в активную форму каспазами. В неумирающих клетках другой представитель этого семейства веществ, Pak1 PAC-p21-activated kinase) , вызывает разборку стресс-фибрилл и ретракцию за счет фосфорилирования короткой цепи миозиновой киназы (MLCK) и уменьшения активации миозина. Таким образом Pak1 может быть важным в разборке стресс- фибрилл и косвенно в реорганизации актина.
Фаза блеббинга.
После округления клеток, которое происходит в процессе фазы высвобождения, наступает фаза блеббинга. В этой фазе на мембране как бы вздуваются многочисленные пузыри, клетка как бы кипит. В это время происходит центростремительное сокращение кортикального актинового кольца за счет активации миозина II . В то же время мембранно-актиновые связи фокально ослабляются, приводя к выталкиванию блебов в зонах, где это ослабление происходит. Обратно направленное усилие, (возможно связанное с миозином I или миозином IV) ретрактирует блебы, и цикл повторяется. Актин и миозин могут концентрироваться в основании блебов, и тонкий слой мембрано-ассоциированых актинов окружает блебы.
Блеббинг не происходит в некоторых клетках, где нет каспазы 3. Похоже, что в них первая фаза (высвобождение) происходит, но они не блеббируют, что заставляет думать, что существует некоторый клеточный механизм проверки хода процесса между стадиями высвобождения и блеббинга.
Миозин II или обычный миозин повидимому обеспечивает силу для динамического мембранного блеббинга как в апоптических так и в неапоптических системах. Ингибирование миозиновой моторной активности или миозиновых активаторов MLCK или RhoA прекращает формирование блебов в апоптических клетках. Понимание роли необычных миозинов основывается на том факте, что общий миозиновый моторный ингибитор (бутадион топоксин BDM) ингибирует ретракцию блебов и на понимании того, какую роль необычные миозино-подобные миозин I и миозин IV играют в регулировке мембранных структур вообще.
Разрушение актинового цитоскелета действием цитохалазина D уменьшает мембранный блеббинг, свидетельствуя, что полимеризация актина и/или полимеризованный актин необходимы для генерации силы.
Связи, которые эти актин-связывающие белки обеспечивают между актиновым цитоскелетом и плазматической мембраной могут фокально нарушаться, позволяя блебам проникать в места, где мембрана не укреплена цитоскелетом. Фордин (неэритроцитный спектрин) был зарегистрирован в блеббинге много раз, так как он легко расщепляется во многих местах каспазами и калпанами. Эзрин, моезин, радиксин - семейство актин-мембрано-связывающих протеинов также дефосфолирируется и диссоциирует из мембраны во время фазы экзекуции. Эзрин может быть связан каспазами.
Эффекторы. Хотя каспазы связывают цитоскелетные компоненты подобные фодрину и следовательно включены в процессы на этой стадии, многие клетки блеббируют днями, в то время как каспазы в них, по-видимому, ингибированы. Активаторы миозина MLCK, который активирует немышечный миозин II путем фосфорилирования регуляторной короткой цепи, необходимы для инициации и развития блеббинга. Было показано, что RhoA тоже важен для блеббинга, возможно, за счет активизации Rho киназы, которая фосфорилирует и ингибирует фосфатазу миозина.
Для блеббинга необходимо большое количество ATP (для поддержания сократимости миозина) так что генерация энергии в клетках не затрагивается.
Фаза конденсации.
Все клетки в конце концов заканчивают блеббинг. При нормальных условиях это обычно происходит с удивительной регулярностью примерно через час. Прекращение блеббинга сопровождается фрагментацией клетки в маленькие апоптические частицы (тела) или конденсацией в маленькую сферу, причем актин и микротрубочки в значительной степени разобраны или деградированы.
Стадия конденсации может просто представлять собой конечный результат блеббинга, когда сокращение оказывается достаточно сильным чтобы сжать апоптические тела. Однако ингибиция каспаз может остановить процесс формирования апоптического тела без прекращения блеббинга. Следовательно, формирование апоптического тела, хотя и является прямым продолжением блеббинга, должно представлять собой отдельную стадию фазы экзекуции, немедленно следующую за блеббингом. Может существовать некий внутренний механизм контроля хода процесса между блеббингом и конденсацией или может быть клетка может конденсироваться только после того как цитоскелет был разобран/реорганизован, что позволит перейти к растворению цитоплазмы.
Очень немногое известно относительно спецификации регуляторных аспектов этой финальной стадии апоптоза; однако F-актин, по-видимому, необходим для формирования апоптического тела.
Каспазы наверное играют важную роль, поскольку ингибирование каспаз ведет или к морфологическим изменениям в ходе апоптоза или к задержке клеток в стадии блеббинга, когда они не способны к конденсации. Возможно, роль каспаз в процессе сокращения клеток состоит, в ограничении блеббинга и индукции конденсации. Это может случиться, если каспазы приводят к медленной деградации белков, нужных для блеббинга (например, актина). Другие протеазы могут также быть важными (например, сериновые протеазы и протеасомальные протеазы).
Pak1 киназа, активированная р21 (PAC-p21-activated kinase), по-видимому, важна для формирования апоптозного тела. В некоторых клетках активация протеин кросс-связывающего энзима, трансглютаминазы, была зафиксирована в процессе цитоплазматической упаковки в фазе конденсации.
Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 661; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!