Регуляция актомиозинового взаимодействия.

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 3

В скелетных мышцах регуляция осуществляется на уровне актиновых филаментов с помощью белка тропонина и тропомиозина. Тропонин - комплекс из трех полипептидов: тропонина T , тропонина I и тропонина C (кальций - связывающий). Тропонины C и I образуют глобулярную головку, а T длинный хвост. Тропонин I присоединяется к актину при образовании комплекса с тропонином T и тропомиозином. Образование комплекса препятствует образованию комплекса актина с миозином даже в присутствии кальция. Если к этому комплексу добавить тропонин C построение актин-тропонинового комплекса завершится и актин-миозиновые взаимодействия становятся чувствительными к ионам кальция.

В гладкомышечных и немышечных клетках регуляторный белок кальдесмон, находясь в ассоциации с актином, ингибирует способность последнего активировать магний- АТФазу миозина. При наличии связанного с кальцием кальмодулина кальдесмон отделяется от актинового филамента и его блокирующее действие прекращается.

Следует отметить, что кальций может влиять на процесс сокращения и более сложным способом, меняя супрамолекулярную организацию актиновых филаментов. Это связано с тем, что при повышении концентрации кальция активируются многие режущие белки и происходит отсоединение некоторых сшивающих белков. Образующийся при этом слегка разжиженный гель, как было показано в специальных экспериментах, подвергается более интенсивному сокращению, чем плотный.

В немышечных и гладкомышечных клетках регуляция актомиозинового взаимодействия происходит, в основном, посредством фосфорилирования миозина. Молекула миозина имеет несколько сайтов фосфорилирования. Однако регуляторное значение четко показано в настоящее время лишь для сайта, расположенного на одной из легких цепей миозина (регуляторной). Фосфорилирование этого сайта осуществляется специальным ферментом - киназой легкой цепи миозина - MLCK. MLCK сама по себе также является регулируемым ферментом. Она приобретает активность только в присутствии кальмодулина, связанного с кальцием. Фосфорилирование регуляторной легкой цепи миозина приводит к нескольким последствиям.

Во-первых, происходит конформационное изменение миозина. Если у нефосфорилированного миозина хвост обычно имеет форму петли, то у фосфорилированного хвост выпрямлен. Во-вторых, фосфорилирование стимулирует полимеризацию гладкомышечного и немышечного миозинов. В-третьих, происходит значительное повышение активности активируемой актином Mg2+- АТФазы миозина.

3. Микротрубочки (МТ).

3.1. Полимеризация тубулина. Динамическая нестабильность.

Сборка молекул тубулина напоминает полимеризацию актина. Она самопроизвольно протекает in vitro и сопровождается гидролизом одной молекулы связанного нуклеотида на каждый присоединенный мономер (нуклеотид в случае сборки тубулина – не ATP, а GTP). МТ из выделенного тубулина демонстрируют так называемую динамическую нестабильность, это означает, что одни концы МТ удлиняются, тогда как другие укорачиваются. Переход от фазы роста к фазе разборки является быстрым и случайным.

С усовершенствованием техники прижизненных наблюдений стало возможно исследовать динамику МТ непосредственно в живых клетках. В клетках динамическая нестабильность несколько усложняется наличием пауз - периодов, когда длина МТ не меняется. Поэтому для описания поведения МТ in vivo рассматривают несколько состояний плюс-концов - рост, укорочение (катастрофу), паузу и переходы между ними.

Процесс полимеризации тубулина включает стадии нуклеации и элонгации. Лимитирующей стадией полимеризации является нуклеация. Природа затравок для полимеризации тубулина точно не определена. По-видимому, затравки представляют собой несколько коротких, латерально агрегировавших протофиламентов. Элонгация происходит за счет роста протофиламентов, причем разные протофиламенты не всегда растут с одинаковой скоростью.

3.2. Белки, ассоциированные с МТ.

MAP – microtubule association protein. Или БАМ – белки, ассоциированные с МТ. Наиболее хорошо изучен набор MAP, выделенный из мозга. Эти белки соочищаются с микротрубочками при многократных циклах полимеризации- деполимеризации. Имеется три группы МАР из мозга - высокомолекулярные MAP1 (300-350 кД) и MAP2 (270-285 кД) и низкомолекулярная группа Тау (55-62 кД). Распространение МАР из мозга в других тканях варьирует. Например, МАР2 имеет очень ограниченное распространение, тогда как МАР1А встречается во многих типах клеток.

v МАР2.

Этот белок исследован наиболее подробно, благодаря тому, что он устойчив к нагреванию до 100 град. С и легко может быть отделен от МАР1. МАР2 - не индивидуальный белок; он состоит из двух близких по молекулярной массе и по иммунологическим свойствам белков - MAP2A и MAP2B . Молекулы МАР2 имеют сильно вытянутую форму. Их ассоциация с МТ осуществляется посредством небольшого концевого фрагмента с молекулярной массой около 35 кД. Этот участок очень сходен с соответствующим (связывающимся с микротрубочкой) доменом белка тау. Остальная часть молекулы образует тонкий нитевидный вырост длиной 80-100 нм на поверхности МТ. МАР2, как и другие типы МАР, способствует полимеризации микротрубочек in vitro. Кроме того, МАР2 стабилизирует МТ. Все эти свойства МАР2 (связывание с микротрубочками, стабилизация их, облегчение полимеризации) в значительной степени утрачиваются при фосфорилировании белка. Способностью облегчать полимеризацию МТ и стабилизировать их обладает также фрагмент МАР2, ассоциирующий с МТ. Есть данные о том, что МАР2 способен связывать микротрубочки с актиновыми и промежуточными филаментами, органеллами и микротрубочки друг с другом. МАР-2 участвует в регуляции движения органелл по микротрубочкам, вероятно, стерически препятствуя взаимодействию транслокаторов со стенкой микротрубочки.

v МАР1.

МАР1 состоит по крайней мере из 3 высокомолекулярных полипептидов - MAP1A , MAP1B и MAP1C. Ни один из трех белков не обладает термостабильностью. Компоненты МАР1 не родственны иммунологически ни МАР2, ни друг другу. По-видимому, эти белки, в отличие от МАР2, структурно и функционально не связаны друг с другом. В пользу этого свидетельствует также тот факт, что МАР1А и МАР1В, в отличие от МАР1С, высоко чувствительны к протеазам. Как и МАР2, МАР1 образует выросты на стенке микротрубочки.

МАР1 стабилизирует микротрубочки и способствует их полимеризации аналогично тому, как это делает МАР2. Недавно было обнаружено функциональное значение компонента МАР1С - он оказался ретроградным транслокатором, т.е. белком, способным перемещаться по микротрубочкам от "+"-конца к "-"-концу.

v Тау.

Это наименее изученная группа ассоциированных с микротрубочками белков из мозга. Она содержит более 20 родственных белков. При ассоциации Тау с МТ выросты не образуются. Стабилизирующие и полимеризующие свойства Тау аналогичны таковым МАР1 и МАР2.

3.3. Белки-транслокаторы.

Белки-транслокаторы - белки, осуществляющие движение транспортных пузырьков по филаментам цитоскелета. К отличительной особенности белков этой группы относится свойство преобразовывать энергию АТР в механическое усилие, способное перемещать частицы вдоль микротрубочек или микротрубочки вдоль субстрата. Соответственно, транслокаторы являются механохимическими АТРазами, и их АТРазная активность стимулируется микротрубочками. В отличие от структурных МАР, транслокаторы ассоциированы с микротрубочками только в момент АТР-зависимого перемещения. Они находятся в основном в свободном состоянии в растворе или ассоциированы с мембранными органеллами и частицами. Однако в присутствии негидролизуемых аналогов АТР или в отсутствие свободных нуклеотидов транслокаторы образуют прочный комплекс с микротрубочками и на этом свойстве основаны первоначальные методы их биохимической очистки из экстрактов тканей.

Белки-транслокаторы делятся на две группы: кинезиноподобные белки и динеиноподобные белки. Их главным функциональным отличием является способность в тестах in vitro опосредовать движение частиц по микротрубочкам в противоположные стороны - от минус-конца к плюс-концу для кинезина и от плюс-конца к минус-концу для динеина. В клетке это соответствует движениям от центра и к центру или антероградно и ретроградно соответственно. Недавно был обнаружен еще один белок, относящийся к группе транслокаторов - динамин. Этот белок способен образовывать пучки микротрубочек в отсутствие свободного нуклеотида и индуцировать скольжение микротрубочек в пучке в присутствии GTP или, несколько хуже, в присутствии АТР. Полярность опосредуемого динамином движения пока не изучена.

Кинезиноподобные белки.

Первый транслокатор этого типа был выявлен в гигантском аксоне кальмара. Авторы обнаружили, что в присутствии негидролизуемого аналога АТР, АМР-PNP, в препарате микротрубочек из аксоплазмы появляется минорный белок с молекулярной массой около 120 кДа. При добавлении избытка АТР этот белок экстрагируется с микротрубочек, а в экстракте появляется так называемая транслокаторная активность - при добавлении экстракта к смеси микротрубочек и латекса частицы латекса начинают перемещаться по поверхности микротрубочек. Микротрубочки, в свою очередь, способны перемещаться по поверхности стекла с преадсорбированным на нем экстрактом, содержащим транслокатор.

Аналогичный белок был вскоре обнаружен в других типах клеток. Кинезины из разных источников очень сходны между собой по иммунологическим свойствам и по структуре молекулы. Кинезин является гетеродимером, состоящим из двух тяжелых (110-130 кД) и двух легких (58-70 кД) цепей. Молекула кинезина имеет удлиненную форму с двумя глобулярными головками на одном конце и вееровидным расширением на другом Кинезин является АТФазой, активность которой сильно стимулируется микротрубочками. Сайты связывания АТФ и сайты связывания микротрубочек расположены на глобулярной головке тяжелой цепи.

Методами негативного контрастирования и кругового оттенения платиной было показано, что молекула кинезина имеет форму стержня диаметром 2 - 4 нм и длиной 80 - 100 нм с двумя глобулярными головками на одном конце и веерообразным расширением на другом. В середине стержня находится шарнирный участок, в котором молекула может изгибаться. С помощью декорирования антителами с последующей электронной микроскопией было показано, что легкие цепи локализованы в веерообразном утолщении. Связывание антител с глобулярными головками подавляет транслокаторную активность кинезина. На основании этих данных было сделано предположение, что глобулярные головки содержат участок связывания с микротрубочками. Такое предположение подтверждается также данными молекулярно - генетического анализа, которые показали, что делеция N-концевого участка тяжелой цепи приводила к потере способности к связыванию с микротрубочками. Более того, экспрессированный in vitro N- концевой фрагмент тяжелой цепи размером около 50 кДа обладал механохимической активностью. Этот фрагмент был назван моторным доменом кинезина.

Предполагается, что генерация движения с помощью кинезина аналогична механохимическому циклу в актомиозиновой системе. Кинезин в культивируемых клетках существует как в растворимом, так и в связанном с мембранами виде. Кинезин в клетках ассоциирован с митохондриями, окаймленными пузырьками, синоптическими везикулами, но не связан с аппаратом Гольджи и ядерной мембраной.

Помимо кинезина существует целое семейство кинезиноподобных белков. Их общим свойством является наличие домена размером около 50 кДа, имеющего высокий процент гомологии с моторным доменом кинезина. Вне моторного домена последовательности кинезиноподобных белков уникальны и не имеют гомологии с другими известными транслокаторами. Кроме того, моторный домен может располагаться у кинезиноподобных белков как на N-конце, так и на С-конце.

Несмотря на многочисленные свидетельства транслокаторной активности кинезина in vitro, его функции in vivo до последнего времени не были прямо подтверждены. Первое экспериментальное свидетельство о функциях кинезина в клетках как антероградного транслокатора было получено в работе В.И.Родионова с соавторами в 1991 г. Авторы данной работы получили поликлональные антитела к моторному домену\Кинезин тяжелой цепи молекулы кинезина. Эти антитела ингибировали функции кинезина in vitro и узнавали кинезин из самых различных объектов. Оказалось, что при микроинъекции антител к кинезину в меланофоры рыб происходит полное подавление транспорта пигментных гранул к периферии клетки без нарушения их транспорта к центру. Почти одновременно другая группа авторов получила сходные данные для мышиных макрофагов. При введении в эти клетки антител к кинезину, обладающих аналогичными свойствами, наблюдалось нарушение

способности тубулярных лизосом вытягиваться вдоль микротрубочек.

Динеиноподобные белки.

Отличительной особенностью динеинов является их способность специфически расщепляться под действием ультрафиолета в присутствии ванадата. Эта реакция часто используется для идентификации динеинов. Механизм генерации силы при взаимодействии динеина и микротрубочки, по-видимому, очень сходен с таковым при актомиозиновом взаимодействии и включает в себя циклические процессы ассоциации-диссоциации динеина с микротрубочками, сопряженные с процессами связывания, гидролиза и высвобождения продуктов. В настоящее время выделяют два класса динеинов - аксонемные динеины и цитоплазматические динеины.

Характерным свойством динеина является его способность расщепляться под действием ультрафиолетового облучения в присутствии АТР, магния и солей ортованадата на два фрагмента с молекулярными массами порядка 240 и 180 кДа. Изменение ионных условий приводит к изменению характера такого расщепления. На этом свойстве основаны методы исследования структуры динеина и функций динеина.

Ø Аксонемные динеины.

Этот класс белков первоначально был обнаружен в аксонемах жгутиков и ресничек, где динеины образуют "ручки", ассоциированные с дублетом микротрубочек. Аксонемные динеины осуществляют скольжение соседних наружных дублетов микротрубочек, что приводит к биению жгутиков или ресничек. Лучше всего изучены динеины наружных ручек из ресничек тетрагимены, жгутиков хламидомонады и жгутиков сперматозоидов морского ежа.

Эти динеины содержат три типа полипептидных цепей - тяжелые, промежуточные и легкие. Количество цепей варьирует у разных животных. Молекулярный вес тяжелых цепей составляет 400-500 кД, промежуточных -60 -120 кД, легких - 10-40 кД, а общий вес динеина - 1250-2000 кД. Морфологически динеины наружных ручек содержат 2 или 3 глобулярных домена (соответственно числу тяжелых цепей), которые с помощью тонких нитей соединяются друг с другом наподобие букета в области корешкообразного основания. Промежуточные цепи располагаются именно в области этого основания. На каждой головке динеина имеется по одному сайту связывания с микротрубочками (А-микротрубочкой). Связывание головок с микротрубочками чувствительно к АТФ и разрушается при его добавлении. Динеин является АТФазой, активность которой стимулируется микротрубочками. Участки связывания и гидролиза АТФ также расположены на головках динеиновой молекулы

Ø Цитоплазматические динеины.

Цитоплазматический динеин впервые описан в 1987 г. Оказалось, что известный ранее белок МАР 1С из препарата высокомолекулярных МАР по ряду признаков (коэфффициент седиментации 20S, субъединичный состав, характер расщепления при ультрафиолетовом облучении в присутствии ванадата и АТР, транслокаторная активность) совпадает с препаратом аксонемного динеина ресничек и жгутиков. Было предложено назвать этот белок цитоплазматическим динеином.

Цитоплазматический динеин является ретроградным транслокатором, в отличие от кинезина способным использовать только энергию АТР, но не других NТР. Его транслокаторная активность ингибируется АМР-РNР, ванадатом и азидом натрия.

Цитоплазматический динеин относится к двухголовым динеинам. МАР1С содержит две неидентичные тяжелые цепи (по 400 кД), три промежуточные (74, 59 и 57 кД) и четыре легкие цепи. Морфологически МАР1С состоит из двух глобулярных головок, соединенных парой стебельков. Как и другие динеины, МАР1С обладает активируемой микротрубочками АТФазной активностью. При очистке цитоплазматического динеина из нервных тканей одновременно с ним очищаются и полипептиды 150 и 45 кДа. Эти полипептиды, видимо, являются кофакторами, необходимыми для транслокаторной активности белка, общими для динеина и кинезина.

Хотя все данные свидетельствуют в пользу того, что цитоплазматический динеин in vivo индуцирует движение частиц в ретроградном направлении, данный факт нуждается в прямом экспериментальном подтверждении.

3.4. Антимитотические агенты.

Антимитотические агенты – вещества, которые способны блокировать клетки в митозе.

v Колхицин. Молекулы колхицина прочно связываются с молекулами тубулина (образуя эквимолярный комплекс) и препятствуют тем самым их поляризации. Обработка делящихся клеток колхицином вызывает через несколько минут исчезновение веретена деления и блокирует клетки в митозе.

v Колцемид. Производное колхицина. Также как и колхицин, прочно связывается с тубулином и препятствует его полимеризации.

v Нокодазол не является производным колхицина, но принцип его действия такой же.

v Таксол. Растительный алкалоид из тиса. Таксол прочно связывается с МТ и стабилизирует их. Таксол связывается по сайту, который расположен рядом с ГТФ-связывающим сайтом.

v Винбластин и винкристин. Относится к винкаалкалоидам. Эти вещества связываются с другим, чем колхицин, участком молекулы тубулина. Как и колхицин, винкаалкалоиды эффективны с субстехиометрических концентрациях. Отличительной особенностью винкаалкалоидов является их способность индуцировать образование тубулиновых паракристаллов в цитоплазме.

4. Процесс распластывания.

4.1. Стадии распластывания.

Морфология распластывания детально изучена на примере нормальных фибробластов (культура клеток). Эти исследования позволили выделить несколько стадий распластывания и поляризации.

На стадии начального прикрепления клетка соприкасается с подложкой нижней поверхностью, при этом выростов плазматической мембраны не обнаруживается. В районе контакта клетки с субстратом мембрана уплощена повторяет форму субстрата; в целом такие клетки мало отличаются от суспендированных. Затем мембрана образует пузыревидные выпячивания вытянутой формы, приподнятые над субстратом на 1-2 мкм. От нижней поверхности таких почек отходят 1-2 микроворсиники. Уже через несколько минут после контакта с субстратом клетка начинает образовывать псевдоподии, которые либо прикрепляются в к подложке, либо вновь втягиваются внутрь.

Принято выделять несколько разных типов псевдоподий:

― филоподии – цилиндрические псевдоподии диаметром 0,3,-0,52 мкм;

― ламеллоподии – уплощенные псевдоподии шириной 2-5 мкм;

― лобоподии - большие отростки диаметром 1-2 мкм;

― рафлы – большие складки на верхней поверхности.

Таким образом, через 0,5 часа после посадки фибробластов на субстрат они имеют небольшие размеры, выпуклый центр и отростчатую периферию.

Следующая стадия распластывания – радиальная – по разным данным занимает от нескольких минут до трех часов. На этой стадии центральная часть клетки уплощается, наружный край клетки по-прежнему активен. В начальной стадии распластывания наиболее частыми являются филоподии, прикрепленные к подложке своими концами, затем ламеллоподии, прикрепленные в нескольких точках, и рафлы. При этом преобладание различных типов псевдоподий зависит от специфичности используемой культуры клеток. Например, для фибробластов хомяка характерны ламеллоподиии, а для фибробластов мыши – филоподии.

Началом третьей стадии – стадии поляризации – принято считать появление выраженной неравномерности распластывания. Часть клеточного края теряет ламеллярную цитоплазму, а часть края, напротив, содержит обширные ламеллярные выросты. На начальной стадии распластывании клетка приобретает форму неправильного многоугольника или форму звезды. Постепенно часть выростов втягивается и исчезает, число направлений распластывания сокращается до 2-4-х. В клетке появляются стабильные и активные участки клеточного края. Клетки приобретают веретеновидную форму.

4.2. Распластывание. МТ и ПФ.

Процесс распластывания сопровождается ростом МТ из центра в периферические участки клетки. На мышиных эмбриональных фибробластах была детально прослежена перестройка системы МТ в процессе распластывания.

На ранних стадиях в филоподиях и формирующейся ламеллярной цитоплазме МТ отсутствуют. В более распластанных клетках одиночные МТ выходят из околоядерной области и направляются в ламеллу. В клетках с хорошо развитой ламеллярной цитоплазмой, на радиальной стадии распластывания, МТ формируют кольцевой пучок, идущий вдоль клеточного края. Кольцо может располагаться как вдоль самой границы клетки, входя в ламеллу, так и несколько отступя от клеточного края. Сам кольцевой пучок образован дистальными концами МТ, выходящими из околоядерной зоны. На разных расстояниях Мт поворачивают и идут параллельно краю. Вероятно, в состав пучка входят также МТ, не связанные с клеточным центром.

Следует отметить, что формирование и прикрепление псевдоподий при распластывании клеток происходит с непременным участием актиновых микрофиламентов. МТ для этого процесса не обязательным. Начальные этапы распластывания вплоть до радиальной стадии идут и при разрушении МТ. МТ начинают играть ведущую роль лишь на последней стадии распластывания, определяя поляризованную форму клетки.

В суспендированных фибробластах мыши ПФ сконцентрированы в перинуклеарной области цитоплазмы. При распластывании центральная сфера постепенно уменьшается, на ранних стадиях из нее выходят пучки ПФ, на поздних стадиях – отдельные ПФ. Перераспределение ПФ происходит вдоль МТ, приблизительно через два часа после пересадки клеток.

5. Клеточный центр.

5.1. Структура и функции центриолей и центросомы.

Обычно в клетке обнаруживаются 2 центриоли, в течение интерфазы локализованные в околоядерной области. Существенные различия в строении позволили разделить их на 2 типа: материнскую и дочернюю центриоли. Дочерняя центриоль, как правило, ни придатков, ни сателлитов не имеет. 2/3 её внутреннего объёма занимает осевая структура, от которой по направлению к микротрубочкам отходят радиальные элементы. Такое образование получило название "ось со спицами" и располагается в проксимальном и среднем отделах центриоли. Осевой элемент, не имеющий радиальных образований – втулка, может обнаруживаться внутри дистальной и средней частей центриоли.

Характерной особенностью материнской центриоли является наличие на дистальном конце придатков. На поперечных срезах они видны как длинные выросты диаметром около 100нм, отходящие от каждого триплета под углом 60º к боковой поверхности и 45º к оси цилиндра. К настоящему времени доказано, что придатки связаны с В-микротрубочкой триплета и направлены в противоположную от оси закручивания сторону. На концах придатков всегда выделяются электроноплотные гранулы.

Функция придатков точно не определена. Предполагается, что они способствуют взаимодействию центриоли с плазматической мембраной при формировании базального тельца; вероятно, что также может существовать связь и с другими мембранными органеллами. Наличие придатков зависит от фазы клеточного цикла и от типа клетки. Так материнские центриоли в клетках культуры СПЭВ содержат придатки на всех стадиях, включая G0-период. А в гепатоцитах мыши материнские центриоли имеют придатки только в G1, при продвижении по циклу они утрачиваются; клетки интактной печени придатков не формируют.

Другой отличительной особенностью материнской центриоли является наличие сателлитов; в зарубежной литературе чаще употребляется термин субдистальные придатки. От придатков они отличаются бóльшей вариабельностью в размерах, числе и расположении. Сателлиты состоят из конусовидных поперечно-полосатых оснований и небольших круглых головок; на одну центриоль приходится 1-5 подобных образований. В отличие от придатков, сателлит прикрепляется одновременно к 2-3 триплетам. Показано, что сателлиты являются центром организации микротрубочек. Интересно, что придатки и сателлиты присутствуют у одних и тех же центриолей – материнских. Биохимическим маркером созревания центриоли является белок ценексин, который присутствует только в зрелой материнской центриоли.

В настоящее время выделяют следующие функции центриолей:

— репликация центриолей;

— образование материнской центриолью первичной реснички;

— организация перицентриолярного материала; в отсутствие центриолей центросома не формируется; однако, с другой стороны, в литературе описаны и данные о существовании бесцентриолярной центросомы в клетках. Согласно последней точке зрения все центросомы можно разделить на две группы: центриолярные (имеющие в своем составе центриоль) и бесцентриолярные (центросомы, в которых центриоль отсутствует).

В перицентриолярном материале располагаются так называемые "затравки" микротрубочек, имеющие вид колец и спиралей диаметром около 30 нм. Непосредственно к ним и прикрепляются микротрубочки. "Затравки", по-видимому, могут входить в состав микротрубочек при полимеризации. "Затравки" часто расположены кластерами, получившими название центры нуклеации микротрубочек (ЦНМТ). ЦНМТ могут быть как прикрепленными к центриолярному цилиндру через ножки сателлитов (и тогда они называются головками сателлитов), так и свободными. В последнем случае они получили название фокусов схождения микротрубочек. Кроме того, в области клеточного центра обнаруживаются плотные "вирусоподобные частицы" (ВПЧ); функция их пока не известна. В постсинтетическом периоде интерфазы сателлиты исчезают; одновременно с этим процессом появляется фибриллярное гало – центр образования микротрубочек веретена деления .

Таким образом, совокупность структур, принимающих участие в формировании микротрубочек на протяжении всего клеточного цикла, получила название центросома. В ней выделяют две основные составные части: центриоли и перицентриолярный материал, организованный в митозе в виде гало, а в интерфазе в форме сателлитов, ЦНМТ, центросомного матрикса и перицентриолярных придатков. Окружающие центросому микротрубочки, а также располагающиеся в этой зоне везикулы, образуют центросферу.

Не смотря на то, что центриоли характерны для большинства изученных клеток, их присутствие в составе центросомы не является облигатным. В связи с этим особое внимание хотелось бы уделить функциям центросомы. Наиболее важной функцией центросомы является формирование разных категорий микротрубочек в течение клеточного цикла. То есть центросома является основным центром организации микротрубочек (ЦОМТ) в клетке. Так, в интерфазе центросома образует цитоплазматические микротрубочки, участвующие в распределении органелл и создании полярности клетки, организовывая, таким образом, направленный транспорт. При вступлении клетки в митоз центросома формирует микротрубочки веретена деления. Кроме того, центросома инициирует рост микротрубочек, образующих стенку центриоли.

5.2. Биохимические особенности центриоли и центросомы.

В настоящее время в связи с развитием методов молекулярной биологии всё бóльший интерес вызывает белковая природа центросомы. На данный момент выделено достаточно большое количество белков, предложены способы их классификации. Однако, следует заметить, что пока не было обнаружено ни одного белка, который всегда присутствовал только в центросоме. Мы рассмотрим лишь некоторые, наиболее важные, из них:

1) γ-тубулин – один из постоянных компонентов центросомы, является белком "затравки"

2) Перицентрин – структурный белок перицентриолярного материала, участвует в пространственном расположении остальных участников сборки микротрубочек; при микроинъекции антител происходят нарушения в формировании веретена деления, и даже наблюдается его отсутствие.

3) Центрин (кальтрактин) – основной белок исчерченных корешков, обнаружен также в сателлитах и перицентриолярном матриксе; принимает участие в дупликации центриолей; Ca²⁺-связывающий белок.

4) Моторные белки – осуществляют транспорт по микротрубочкам.

5) р210 – белок, связывающийся с придатками центриолей, он играет роль во взаимодействии с плазматической мембраной.

6) PCM-1 – белок, локализующийся на сателлитах, при помощи динеина участвует в прикреплении цитоплазматических микротрубочек в течение интерфазы.

7) С-Nap1 – белок, специфически связывающийся через киназу Nek2 с проксимальными концами двух центриолей, объединяя их таким образом в интерфазе.

5.3. Нарушения в строении и функционировании центросомы.

Роль центросомы в формировании злокачественных опухолей.

Итак, главной функцией центросомы является формирование интерфазных и митотических микротрубочек. Как уже упоминалось, центросома принимает активное участие в образовании веретена деления, а, значит, и в передвижениях хромосом во время митоза. Можно предположить, что структурные изменения этой органеллы приведут к неравномерному распределению хромосом между дочерними клетками после цитокинеза. Такая гипотеза была высказана ещё в 1914 году Теодором Бовери (Boveri) при изучении атипичного эмбрионального развития морского ежа и анализе структуры опухолевых клеток.

Исследования, проводимые в настоящее время, подтверждают эту идею. Аномальное строение центросом было выявлено в опухолях дыхательных путей, легких, простаты, толстого кишечника, поджелудочной и молочных желез. Центросомные нарушения, обнаруживаемые в клетках, имеющих злокачественный фенотип, можно разделить на 3 группы. К первым относятся собственно изменения в структурной организации центросомы. В частности, было показано увеличение общего объёма центросомы, а также увеличение длины центриолярного цилиндра. Такие дефекты в строении центриолярного цилиндра как: уменьшение числа микротрубочек, С-форма центриоли и увеличение длины были обнаружены и при атеросклерозе сосудов.

Вторая группа нарушений связана с изменениями на биохимическом уровне. Так, в опухолях дыхательных путей был выявлен повышенный уровень фосфорилирования центрина, что в норме характерно только для митотических клеток. Кроме того, в опухолях отмечен и высокий уровень γ-тубулина.

Выявлено, что возникновение центросомных аномалий связано с присутствием в центросоме некоторых регуляторных молекул, в частности белков семейства aurora/Ipl-like kinase. Многие из этих киназ колокализованы с центросомой, участвуя в дупликации центросом, их созревании и движении, необходимых для правильной сегрегации генома. Повышенная экспрессия серин-треониновых киназ aurora выявлена в ряде опухолевых клеточных линий и отмечена их способность индуцировать амплификацию центросом.

Отличительными особенностями трансформированных клеток во всех наблюдаемых типах рака были: наличие избыточного перицентриолярного материала и множественность центриолей. Они и составляют третью группу выявляемых нарушений. Часто в таких клетках обнаруживается атипичное веретено деления, нарушения в сегрегации хромосом и анеуплоидия.

Хотелось бы также обратить внимание на тот факт, что нарушения в строении центросомы были выявлены не только в опухолевых клетках, но и на более ранних стадиях развития злокачественного фенотипа, например, в аденомах. Подтверждением этого служит тот факт, что онкопротеин Е7 папилломовируса человека HPV-16 индуцирует аномальный синтез центросом на ранних стадиях развития злокачественного фенотипа, нарушая при этом экспрессию cdk2. Амплификация центросомы может увеличивать и метастатический потенциал вследствие изменений в системе цитоскелета, что и находит отражение в тканевой архитектуре.

Сопоставление имеющихся данных подтверждает ранее высказанную гипотезу: аномалии центросомы, приводящие к возникновению дефектов веретена деления, вызывают неправильную сегрегацию хромосом и способствуют развитию анеуплоидии. Это приводит к накоплению мутаций в клеточной популяции и, как следствие, к формированию опухоли. Нарушения в размере и числе центросом в опухолевых клетках коррелируют с уровнем нестабильности хромосом, а также с частотой патологических митозов. При этом частота патологических митозов приблизительно в три раза выше в опухолях, где наиболее часто встречаемой патологией является увеличение перицентриолярного материала (по сравнению со всеми другими нарушениями центросом).

Кроме того, во многих злокачественных опухолях человека выявлена инактивация таких регуляторных элементов G1-S-перехода, как Rb-белок и р53, а также повышенная экспрессия циклинов D и E, cdk 4 и 6, ингибиторов cdk p16^INK⁴^A и p15^INK⁴^B .

Таким образом, нарушения в структуре и числе центросом в клетке могут быть важным диагностическим и/или прогностическим признаком малигнизации ткани. Это предполагает изучение центросомы в качестве одной из мишеней раковой терапии.

6. Препараты и ЭМФ.

Цитоскелет.

Цитоскелет в первичных фибробластах. Препарат.

Окраска Кумасси бриллиантовым синим. Относится к группе проционовых красителей. Их молекулы состоят из активной части (дихлортиазинового кольца, специфически реагирующего с аминогруппами белков) и хромофобной части, обусловливающей цвет красителя. Белки пробы взаимодействуют с сульфогруппами красителей, образуя комплекс белок-краситель, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации белка в исследуемом растворе. Основной недостаток этой группы методов заключается в различной способности разных белков связывать краситель.

Для того, чтобы получить этот препарат, необходимо сначала убрать мембранные структуры. Для этого клетки обрабатывают хелатонами, например, тритоном. На препарате видны прямые нити по краям – это стресс-фибриллы.

На фотографии (световая фазово-контрастная микроскопия) представлен первичный мышиный фибробласт (живой).

Цитоскелет в фибробласте. ЭМФ.

Для создания этого препарата сначала также убирают мембранные структуры. Затем получают платиновую реплику (метод напыления). Далее препарат опускаем в плавиковую кислоту, которая растворяет стекло. Полученные тонкие (10-15Å) пленки напыления «ловятся» на бледны для электронной микроскопии.

Ø Цитоскелет в фибробласте. Ведущий край клетки.

На фотографии видна область фокального контакта. Вследствие небольшого увеличения определить тип филаментов цитоскелета невозможно, но очень хорошо видно, что они образуют сеть.

Ø Цитоскелет в фибробласте. Околоядерная зона.

На фотографии видны белки ламины, актиновые филаменты и α-актинин.

Ø Цитоскелет в фибробласте. Участок цитоплазмы.

Хорошо прослеживаются все три компонента цитоскелета

Иммунофлуорисценция промежуточных филаментов.

Промежуточные филаменты. ЭМФ.

На ЭМФ представлены 2 типа промежуточных филаментов: белки ламины и филаменты, расположенные в цитоплазме.

Актиновые филаменты. Ведущий край клетки.ЭМФ.

Строение саркомера. ЭМФ,

Иммунофлуоресценция актиновых микрофиламентов в фибробласте кожи человека.

Иммунофлуоресценция тропомиозиновых микрофиламентов в фибробласте кожи человека.

Иммунофлуоресценция миозиновых микрофиламентов в фибробласте кожи человека.

Микротрубочки. Метод фазового контраста. Иммунофлуорисценция – α-тубулин.

Поляризованный движущийся фибробласт.

На фото: красным цветом окрашены микрофиламенты, связанные с антителами к актину; зеленым – микротрубочки, окрашенные антителами к α-тубулину

Центросома и центриоль.

1. Клетка культуры ткани в S-G2-периоде.

Иммунофлуорисцентное окрашивание антителами к γ-тубулину.

2. Схема строения центриоли.

На фото представлена дочерняя центриоль, характерным признаком которой является наличие «оси со спицами».

3. Центриоль опухолевой клетки.

Как уже говорилось выше, аномальное строение центриолей было выявлено во многих опухолевых клетках. На данной ЭМФ представлена центриоль, сочетающая в себе признаки дочерней и материнской центриоли: одновременное наличие придатков и «оси со спицами».

Дата добавления: 2018-09-22; просмотров: 285; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 23

Мы поможем в написании ваших работ!