Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий
титрационным методом.
Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды на жидкую питательную среду с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификацией колоний по культуральным и биохимическим тестам.
Проведение анализа.При исследовании питьевой воды качественным методом засевают 3 объема по 100 см3. При исследовании воды с количественным определением ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 см3, 3 объемов по 10 см3, 3 объемов по 1 см3. Посев 100 см3 и 10 см3производят соответственно в 10 и 1 см3 концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 см3 пробы проводят в 10 см3 среды обычной концентрации. Посевы инкубируют 48 часов при 37 оС. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа или только помутнение, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо для получения изолированных колоний. Посевы на среде Эндо инкубируют 18-20 часов при 37 оС.
При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактоза-положительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.
Факт наличия ОКБ необходимо подтвердить если: в среде накопления отмечено только помутнение; принадлежность к лактоза-положительным колониям вызывает сомнение.
|
|
|
В этих случаях: проверяют наличие окрашенных отпечатков на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии; выполняют оксидазный тест; подтверждают принадлежность к Граму; подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1-2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой с последующей инкубацией посевов при 37 оС в течение 24-48 часов.
Для определения ТКБ делают посев 2-3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора среды Эндо в пробирки с лактозной средой, нагретой до 44 оС и инкубируют в термостате 24 часа при 44 оС. Допускается просмотр посевов через 4-6 часов.
При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактоза-положительных бактерий и выявлении их способности ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 часов при 44 оС дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.
Учет результатов. При исследовании 3 объемов по 100 см3 результаты оценивают качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из них, делается запись в протоколе «обнаружены в 100 см3». При исследовании полуколичественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по таблице «Расчет НВЧ бактерий в 100 см3 питьевой воды» в методических указаниях 4.2.1018-01. Результат сообщают без доверительного интервала. При отрицательном ответе – «не обнаружены в 100 см3».
|
|
|
Норматив: ОКБ и ТКБ должны отсутствовать в 100 см3 воды.
Определение спор сульфитредуцирующих клостридий
Сульфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 оС в течение 16-18 часов.
Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным и подсчете черных колоний.
Проведение анализа.Пробу воды 20 см3 прогревают на водяной бане в пробирках 15 минут при 75 оС для уничтожения вегетативных форм. При исследовании хлорированной воды прогревание пробы можно не проводить.
Из каждой пробы питьевой воды делают посев или фильтруют 20 см3. При необходимости подбирают объемы с таким расчетом, чтобы в посевах (в фильтрах) выросло не более 10-15 колоний.
Определение методом фильтрования в пробирках. Перед посевом железо-сульфитный агар в пробирках расплавляют на водяной бане при 70-80 оС. После фильтрования установленного объема воды мембранный фильтр стерильным пинцетом берут за два противоположных края и согнув в виде «трубочки» помещают в пробирку с горячим агаром. Пробирку с агаром быстро охлаждают в холодной воде. Посевы культивируют 16-18 часов при 44 оС.
|
|
|
Определение методом фильтрования в чашках Петри. Чашки Петри заливают тонким слоем железо-сульфитного агара. После фильтрации фильтр помещают на застывшую питательную среду фильтрующей поверхностью вниз. Затем заливают расплавленным железо-сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Посевы культивируют 16-18 часов при 44 оС.
Определение прямым посевом. В стерильные пробирки вносят по 5 или 10 см3 исследуемой пробы воды, заливают горячим железо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Пробирку быстро охлаждают. Посевы инкубируют при 44 оС в течение 16-18 часов.
Учет результатов. Количественному учету подлежат только посевы, в которых получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают в колониеобразующих единицах спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 см3 воды. При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ «не обнаружены в 20 см3 воды». При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают «обнаружено в 20 см3».
|
|
|
Норматив: споры сульфитредуцирующих клостридий должны отсутствовать в 20 см3 питьевой воды.
Определение колифагов.
Колифаги — бактериальные вирусы (бактериофаги), заражающие Escherichia coli и, в результате, формирующие зоны лизиса (бляшки) бактериальной культуры, засеянной «газоном» на питательном агаре через 18 часов инкубирования при 37 оС.
Титрационный метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает предварительное накопление колифагов в среде обогащения на культуре E.coli и последующее выявление зон лизиса (просветления) газона E.coli на питательном агаре. Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.
Проведение качественного анализа. В исследуемую пробу воды объемом 100 см3 вносят питательный бульон и подготовленный смыв тест культуры E.coli, помещают в термостат и инкубируют 18 часов при 37 оС. Затем из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 см3, добавляют хлороформ, пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой, встряхивают и оставляют при комнатной температуре до полного осаждения хлороформа. В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют приготовленный смыв культуры E.coli. В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 см3 обработанной хлороформом пробы, заливают смесью расплавленного и остуженного до 45-49 оС питательного агара и осторожно покачивают для равномерного перемешивания пробы воды и агара. После застывания чашку переворачивают и инкубируют в термостате 18 часов при 37 оС. Параллельно проводят контроль культуры E.coli.
Учет результатов. Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветлении нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 см3 воды. При наличии зон лизиса в контроле культуре результат считается недействительным.
Проведение количественного анализа.Исследуемую пробу воды в количестве 100 см3 разделяют на шесть порций: 1 флакон с 50 см3 и 5 пробирок с 10 см3. К 50 см3 пробы добавляют 5 см3 десятикратного питательного бульона и 0,5 см3 смыва E.coli. В каждые 10 см3 пробы вносят по 1 см3 десятикратного питательного бульона и по 0,1 см3 смыва бактерий.
Для контроля культуры 0,1 см3 смыва E.coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. Посевы инкубируют 18 часов при 37 оС.
Затем из объема 50 см3 отливают в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавляют по 1 см3 хлороформа. Пробирки закрывают резиновыми пробками, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре для осаждения хлороформа.
В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют смыв E.coli. Приготовленную смесь разливают в две чашки Петри: одну чашку для контроля культуры E.coli на лизогенность и одну чашку для исследуемой пробы воды. После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделяют на 6 секторов и маркируют в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки наносят пастеровской пипеткой (или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости. После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку помещают в термостат при 37 оС на 18 часов.
Учет результатов. Просмотр результатов осуществляют в проходящем свете. Учитывают наличие зон просветления (лизиса) на секторах газона E.coli. При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха. Пробу считают положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. Оценку проводят по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ). В протоколе анализов указывают наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды в диапазоне возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел – верхний предел) колифагов в 100 см3. Результат полуколичественный. При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считают недействительным.
Прямой метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает исследование нормируемого объема воды (100 см3) путем его прямого посева и последующего подсчета зон лизиса (бляшек) на газоне E.coli в чашках Петри с питательным агаром. Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно с титрационным методом при исследовании по эпидемическим показаниям.
Проведение анализа. В питательный агар, расплавленный и остуженный до 45-49 оС добавляют смыв E.coli и перемешивают. Исследуемые 100 см3 воды разливают по 20 см3 в большие пробирки, нагревают до 35-44 оС и немедленно разливают в 5 чашек Петри. Затем в каждую чашку сразу же вносят по 20 см3 смеси агара с культурой E.coli. Для контроля культуры E.coli в одну чашку Петри вносят 20 см3 стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до 35-44 оС, заливают 20 см3 приготовленного агара с E.coli. Содержимое чашек осторожно перемешивают. Чашки с застывшим агаром помещают вверх дном в термостат и инкубируют в течение 18 часов при 37 оС.
Учет результатов.Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Учет результатов осуществляют подсчета и суммирования числа бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.
Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5-7 мм в диаметре) с четко выраженными либо стертыми границами.
При высоких концентрациях фага можно наблюдать «ажурный» газон Е. coli, рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного лизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.
Окончательный количественный учет прямого посева проводят через 18 часов. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. Если отмечен сливной рост бляшек и подсчет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: «обнаружено в 100 см3воды». При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.
Норматив: В 100 см3 исследуемой воды должны отсутствовать БОЕ колифагов.
1.2. Выявление Legionella pneumophila в объектах окружающей среды
В настоящее время род Legionella включает около 50 видов бактерий, обитающих в пресноводных водоемах в ассоциациях с сине-зелеными водорослями и в организмах свободноживущих простейших. Большинство видов не представляет опасности для человека.
В воде легионеллы размножаются, что происходит в диапазоне температур, равных 25-45 оС. Условия для размножения легионелл в искусственных водных системах (системы охлаждения и кондиционирования, градирни, компрессорные устройства, джакузи, медицинское оборудование и др.) более благоприятны, чем естественные, что и приводит к накоплению высоких концентраций бактерий. Основной фактор передачи – водный мелкодисперсный аэрозоль, образуемый системами водных коммуникаций.
Болезнь легионеров (острая пневмония с токсическим синдромом) вызывает L. pneumophila. Поражения респираторного тракта также спорадически вызывают L. micdadei и L. bozemanii. Оппортунистические заболевания могут вызывать L.micdadei, L.longbeachae, L.dumoffii и L.bozemanii, особенно при нарушениях клеточного иммунитета. Остальные виды не патогенны для человека.
Санитарно-микробиологическому исследованию на обнаружение возбудителя болезни легионеров (L. pneumophila) подлежат в порядке надзора:
1. Системы кондиционирования и вентиляции, водонагревательные и охладительные системы
2. Медицинское оборудование и инструментарий
3. Бассейны
4. Аквапарки
5. Джакузи
6. Фонтаны
Выявление L. pneumophila проводят также в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидемиологическом расследовании вспышек болезни легионеров.
Отбор проб.Пробы воды объемом 0,5-1,0 дм3 отбирают в стерильные емкости. Для дехлорирования воды используют кристаллы гипосульфита натрия.
Поверхностные и глубинные пробы отбирают специальными батометрами.
Смывы с объектов (оборудования для кондиционирования и вентиляции, водонагревательных и охладительных систем, медицинского инструментария) забирают тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором и помещают в ту же пробирку.
Поскольку легионеллы способны к образованию биопленок на синтетической и резиновой поверхности водопроводного, промышленного, лабораторного и иного оборудования, связанного с циркуляцией и хранением воды, биопленки также забирают для исследования. Соскобы влажных биопленок с поверхности, находящейся под водой или на границе воды и воздуха, берут сухими тампонами и помещают во флакон или в пробирку. С высохшей поверхности биопленки забирают тампонами, увлажненными стерильным физиологическим раствором и помещают в пробирку со стерильным физиологическим раствором. Доставку проб осуществляют при температуре 6-24 оС.
Подготовка проб к исследованию.В случае сильной загрязненности образцы воды фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр с помощью стеклянной воронки. Затем воду пропускают через мембранный фильтр, который переносят после фильтрации в стерильный флакон с 10 см3 физиологического раствора. Содержимое флакон 1-2 мин перемешивают на встряхивателе или 10 мин на качалке и затем центрифугируют 30 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют 1 см3 стерильного физиологического раствора и переносят в стерильную пробирку.
Для снижения уровня загрязненности сконцентрированной пробы посторонней микрофлорой одну её часть прогревают 30 мин при 50 оС, а другую обрабатывают кислотным буфером КСl-HCl (рН 2,2) в течение 4 мин.
Образцы биопленок, смывы с поверхностей концентрируют с помощью центрифугирования, кислотной и термической обработок.
Проведение анализа.Концентрированные, обработанные кислотным буфером и прогретые образцы засевают по 0,1 см3 на чашки с буферным угольно-дрожжевым агаром (БУДРАГ) с ростовой и селективной добавкой. Помещают в термостат при 37 оС до 10 дней во влажной атмосфере в присутствии СО2. Исследование посевов начинают с 2 суток. Колонии легионелл на селективной среде имеют вросший центр, зернистую или блестящую поверхность; окрашены в серовато-голубоватый или зеленоватый цвет. Идентифицируют легионеллы по морфологическим, тинкториальным (грамотрицательные палочки), антигенным свойствам (реакция латекс-агглютинации с моновалентными и групповыми сыворотками, иммунофлуоресцентная микроскопия с мечеными антителами), а также идентификацией ДНК бактерий в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Определение количества легионелл в исследуемом материале.Для определения количества легионелл проводят посев исследуемой концентрированной пробы без тепловой и кислотной обработки. Подсчитывают число колоний легионелл, выросших на чашке. Количество легионелл определяют по формуле
Х = cа х b s х 1000см3
где
Х — количество легионелл на литр в исследуемой пробе
a — количество колоний легионелл, выросших на чашке
b — объем концентрата пробы (по завершении этапов фильтрации и центрифугирования) в см3
c — объем, высеянный на чашку, в см3мл
s — объем исходной пробы в дм3
Рекомендуемые значения для оценки уровня контаминации Legionella pneumophila объектов окружающей среды.
1. ПрисутствиеL. pneumophila в воде различных объектов окружающей среды, воде бассейнов, аквапарков, джакуззи, систем кондиционирования воздуха и др. в концентрации менее 1 х 102 микробных клеток на дм3 является допустимым и не требует проведения профилактических мероприятий.
2. Концентрация легионелл в диапазоне от 1 х 102 до 9 х 103 микробных клеток на дм3 не представляет эпидемической опасности, но требует ежемесячного микробиологического контроля и проведения профилактических мероприятий.
3. При обнаружении легионелл в концентрации 1 х 104 микробных клеток на дм3 и выше делают вывод о колонизации данного объекта легионеллами в концентрации, представляющей эпидемическую опасность и требующей дезинфекционных и профилактических мероприятий.
Цель занятия:
— изучить микрофлору воды и ее значение в передаче инфекционных заболеваний
— изучить методы отбора проб воды
— изучить методы санитарно-микробиологического исследования воды
Мотивационная характеристика темы:
Знание микрофлоры объектов окружающей среды и методов санитарно-микробиологического исследования необходимы врачу любого профиля.
Студент должен знать:
— определение, цели, задачи санитарной микробиологии
— методы и принципы санитарной микробиологического исследования
— санитарно-показательные микроорганизмы: определение, требования к ним,
методы индикации
— микрофлору воды; источники и пути микробного загрязнения водоёмов
— процессы самоочищения водоёмов, сапробность
— возбудителей инфекционных заболеваний, передающихся водным путем
— санитарно-микробиологическое исследование воды: забор проб воды, методы
Исследования
— нормативы содержания санитарно-показательных микроорганизмов в воде
— выявление бактерий L. pneumophila в воде
Студент должен уметь:
— проводить отбор проб воды
— готовить последовательные разведения исследуемого материала
— проводить лабораторные исследования проб воды стандартными микробиологическими методами
— проводить выделение чистой культуры микроорганизма и идентифицировать её по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам
— проводить количественный учет посевов в КОЕ/ см3
— оценивать результаты микробиологических исследований и оформлять на их основе соответствующие заключения;
Студент должен иметь навыки:
— соблюдения санитарно-гигиенического и противоэпидемического режима и техники безопасности в бактериологических лабораториях;
— приготовления микропрепаратов: мазков из чистых культур бактерий, из исследуемого материала для обнаружения микроорганизмов;
— окраски мазков простыми способами (водными растворами фуксина и метиленовой синьки) и по методу Грама;
— микроскопии препаратов в световом микроскопе с иммерсионным объективом;
— дифференциации микроорганизмов по морфологическим признакам в микропрепаратах;
— посева исследуемого материала тампоном, петлёй, пипеткой, шпателем на плотные, полужидкие и жидкие среды;
— посева исследуемого материала глубинным методом;
— определения биохимических свойств микроорганизмов;
— выдачи и оценки результатов санитарно-микробиологического исследования;
— антисептической обработки рук, контаминированных исследуемым материалом и культурами патогенных микробов;
— обеззараживания отработанного инфицированного материала и контаминированных патогенными микробами объектов внешней среды.
Вопросы для самоподготовки и самоконтроля:
1. Санитарная микробиология. Предмет и задачи санитарной микробиологии. Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах
2. Санитарно-показательные микроорганизмы, указывающие на фекальное загрязнение объектов окружающей среды. Их характеристика.
3. Санитарно-показательные микробы, указывающие на загрязнение воздуха. Их характеристика.
4. Санитарно-показательные микроорганизмы — индикаторы процессов самоочищения внешней среды
5. Микрофлора воды: аутохтонная и аллохтонная.
6. Возбудители инфекционных заболеваний, передающиеся водным путем.
7. Зоны самоочищения в открытых водоёмах.
8. Характеристика показателей микробного загрязнения воды.
9. Определение общего микробного числа воды, нормативы.
10. Определение спор сульфитредуцирующих бактерий в питьевой воде, нормативы.
11. Определение колиформных бактерий в питьевой воде, нормативы.
12. Определение колифагов в питьевой воде, нормативы
13. . Выявление Legionella pneumophila в воде
Ситуационные задачи
1. Помощник санитарного врача отобрал пробу воды из разводящей сети городского водопровода. При этом он обжег кран при помощи тампона, смоченного в спирте, спустил воду при полностью открытом кране, не менее 10 минут, заполнил водой стерильную емкость, снабженную пробкой и колпачком. Оцените правильность его действий.
2. При исследовании воды из разводящей сети городского водопровода получены следующие результаты: ОМЧ в 1 см3 воды-30 КОЕ. ОКБ и ТКБ отсутствовали в 333 см3воды. Споры сульфитредуцирующих клостридий отсутствовали в 20 см3 воды. Бляшкообразующие единицы (БОЕ) колифагов отсутствовали в 100 см3 воды. Дайте оценку санитарно-микробиологического состояния воды.
3. При исследовании воды из централизованной системы кондиционирования и увлажнения воздуха в хирургическом стационаре обнаружены Legionella pneumophila в концентрации 1х102 микробных клеток в 1 дм3 . Какие мероприятия должны быть проведены?
Оснащение занятия.
На группу:
Таблицы
«Определение общего числа микроорганизмов в воде централизованного водоснабжения»
« Определение ОКБ и ТКБ в воде методом мембранной фильтрации»
«Определение ОКБ и ТКБ в воде титрационным методом»
«Определения спор сульфитредуцирующих клостридий в воде»
«Определение коли-фагов в воде»
«Выявление бактерий Legionella pneumophila в воде»
На рабочее место:
I день исследования
— исследуемая питьевая вода 0,5 дм3
— 2 стерильные чашки Петри
— 2 пробирки с расплавленным и остуженным МПА
— 3 флакона с 10 см3 концентрированной лактозо-пептонной среды и поплавками
— 3 пробирки с 1 см3 концентрированной и 3 пробирки с 1 см3 обычной концентрации лактозо-пептонной среды и поплавками
— бактериологические петли
— спиртовки
— стерильные пипетки (1 см3 и 10 см3)
— карандаш по стеклу
II день исследования:
— посевы на МПА
— посевы на ЛПС
— лупа с 2-5 -кратным увеличением
— чашки Петри со средой Эндо
— бактериологические петли
— спиртовки
— карандаш по стеклу
Ш день исследования
— посевы на Эндо
— предметные стекла
— СИБ-оксидаза
— 3% раствор KOH
— бактериологические петли
— спиртовки
— 2 пробирки с лактозо-пептонной средой и поплавками,
одна предварительно прогретая до 44° С
— карандаш по стеклу
IV день исследования
— посевы на ЛПС
Учебная карта занятия.
1. Ознакомиться с задачами санитарной микробиологии и принципами проведения санитарно-микробиологических исследований.
2.Ознакомиться с основными понятиями и терминами: ОМЧ, титр, индекс, НВЧ
3.Изучить основные характеристики и группы санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ)
4.Изучить методы забора проб питьевой воды
5.Изучить методы санитарно-микробиологического исследования питьевой воды централизованного водоснабжения и критерии оценки санитарно-гигиенического состояния.
6. Изучить методы выявления Legionella pneumophila в воде.
7. Провести санитарно-микробиологическое исследование воды централизованного водоснабжения на кафедре микробиологии.
Протокол №1
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 556; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!