Методы определения числа бактерий и бактериальной массы.
Впопуляции бактерий не все клетки жизнеспособны. Живыми считаются те клетки, которые могут образовывать колонии на (или в) агаризованной среде либо суспензию в питательном растворе. Эти жизнеспособные клетки выявляют специальными методами, предназначенными для определения числа живых клеток. В общее же число клеток включают все видимые или иным способом выявленные клетки; сюда, следовательно, входят также мертвые или поврежденные клетки.
Общее число клеток.
1) Самым распространенным методом определения общего числа клеток служит их подсчет под микроскопом в тонком слое с помощью «счетной камеры» (например, по Нейбауэру, Тома или Петрову-Хаузеру). Если толщина слоя 0,02 мм, а сторона квадрата 0,05 мм (объем 5 • 10 - 8 см3), то для того, чтобы определить число клеток в 1 мл, следует найденное их число умножить на 2-107.
2) Один из самых старых методов состоит в сравнении с известным числом каких-либо других малых частиц, например эритроцитов (около 5 • 106 эритроцитов на 1 мл).
3) Значительно облегчает работу применение электронного счетчика («счетчика Каултера»). Действие его основано на снижении проводимости раствора электролитов при прохождении одной бактерии через узкое отверстие.
4) Если на 1 мл приходится менее 106 клеток, для определения их числа пригоден метод мембранных фильтров. Морскую, прудовую или питьевую воду пропускают через мембранный фильтр, а затем этот фильтр сушат, окрашивают, просветляют и производят подсчет клеток под микроскопом.
|
|
|
Число живых клеток.
Обычно подсчитывают число колоний, образуемых жизнеспособными клетками в благоприятных для роста условиях. Если пользуются чашечным методом Коха, то равные доли соответственно разбавленной гомогенной суспензии клеток смешивают с расплавленной агаризованной средой (40-45°С) и выливают на чашки Петри. Можно также размазать суспензию по поверхности агара в чашке Петри с помощью (треугольного) шпателя Дригальского или же осадить клетки после фильтрования на агаризованную среду или на картонные диски с питательной средой. Во всех случаях после надлежащей инкубации подсчитывают число колоний. Применение чашечного метода Коха, а также различных его модификаций предусматривает подсчет клеток одного вида из гомогенных суспензий; эти методы непригодны для подсчета клеток разных видов из смешанных популяций.
Определение бактериальной массы.Выбор метода для определения бактериальной массы зависит от того, с какой целью это определение производится. Для оценки урожая обычно взвешивают сырые или сухие отцентрифугированные клетки. При определении интенсивности обмена или ферментативной активности исходят из содержания в клетках белка или азота. Часто выбор метода диктуется такими соображениями, как простота или быстрота работы. В повседневной практике предпочтение отдается не прямым, а косвенным методам (после соответствующей калибровки).
|
|
|
Прямые методы.
1) Сырую биомассу определяют после осаждения клеток центрифугированием. После центрифугирования отмытых клеток можно определить сухую массу. Оба метода не свободны от довольно больших систематических ошибок.
2) Гораздо большую точность обеспечивает определение общего азота (метод микро-Кьельдаля и микродиффузионный метод определения аммиака), а также определение общего содержания углерода (по ван Слайку-Фолчу).
3) В повседневной практике часто определяют содержание бактериального белка. Хорошие результаты дают модификации биуретового метода и другие колориметрические методы. Микрометоды основаны на измерении количества характерных компонентов белка: тирозина, триптофана (по Лоури или Фолину).
Косвенные методы.
1) Для определения клеточной массы весьма полезны методы, основанные на измерении мутности клеточных суспензий. На практике обычно определяют оптическую плотность суспензии (измерение экстинкции, турбидиметрия). Для некоторых целей более точные результаты дает определение светорассеяния (нефелометрия). Однако прямая (линейная) зависимость между обоими этими показателями и бактериальной массой наблюдается лишь при очень низких плотностях клеточных суспензий. Поскольку рассеяние света зависит от диаметра, формы и показателя преломления рассеивающих частиц, в том числе клеточных включений, приходится от случая к случаю проверять соотношение между оптическими величинами и более прямыми показателями, такими как сухая биомасса, содержание в ней азота или содержание углерода.
|
|
|
2) Показатели интенсивности метаболизма, непосредственно связанные с ростом (поглощение О2, образование СО2 или кислот), могут служить адекватной мерой бактериальной массы. К такого рода определениям прибегают в тех случаях, когда другие методы оказываются непригодными, например при очень малой плотности клеточных суспензий. Для измерения можно применять титрометрические, манометрические, электрохимические и другие методы.
Хемостатное культивирование.
Хемостатный метод культивирования клеток базируется на использовании биореактора, в который с постоянной скоростью подается питательная среда и одновременно же скоростью (например, слив по уровню) отбирается клеточная суспензия. При этом объем выращиваемой суспензии остается постоянным.
|
|
|
Хемостат состоит из сосуда-культиватора, в который из особого резервуара поступает постоянной скоростью питательный раствор. При этом один из компонентов (обычно кислород) поступает в количестве, не достаточном для обеспечения максимальной скорости роста культуры. В результате реактор с биообъектом приобретает свойства саморегулирующейся системы. Например, если скорость разбавления и вымывания биомассы превышает скорость роста клеток, то наступает разбавление культуры свежей средой. Это ведет к повышению концентрации компонента, ограничивающего рост, вследствие чего скорость роста культуры увеличивается. В реакторе начинает концентрироваться биомасса. Увеличивающаяся популяция клеток активно использует субстрат, его концентрация падает, что ведет к торможению роста культуры.
Самый простой вариант хемостата включает насос, постоянно нагнетающий питательную среду в биореактор, и выпускную трубу, по которой жидкость из биореактора вытекает, как только ее уровень поднимается выше горловины этой трубы.
Хемостатное культивирование основано на том, что в простейшей форме рост бактерий можно предоставить как совокупность реакций, в которых скорость роста культуры определяется самой медленной реакцией метаболизма. Хотя в растущей культуре осуществляется метаболизм многих питательных веществ, скорость роста культуры в любой момент времени определяется скоростью метаболизма лишь одного питательного субстрата. Тот субстрат, или тот компонент питательной среды, метаболизм которого осуществляется медленнее всего и который таким образом определяет скорость роста бактериальной культуры, принято называть лимитирующим фактором.
Хемостатный метод культивирования незаменим в лабораторных исследованиях физиологии микроорганизмов и клеток тканей. В промышленности он применяется при наращивании микробной биомассы, если известно, какой именно фактор ограничивает рост.
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 1819; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!