Реакция иммунофлуоресценции, цели использования в вирусоло-гии, сущность, плюсы и минусы. Компоненты реакции, прямой и непрямой метод постановки.

РИФ-это серологическая реакция в результате которой антитело, меченное флюорохромом образует со специфическим антигеном светящийся комплекс, наблюдаемый в люминесцентный микроскоп. Цели использования:1)Обнаружение и и идентификация неизвестного вирусного антигена 2)для обнаружения противовирусных антител . Приготовление препаратов для РИФ:Предметные стекла должны быть чистыми тонкими обезжиренными .1)Препараты-отпечатки: кусочек ткани кладут на фильтровальную бумагу сложенную в 4-6 слоев. К поверхности среза прикасаются предметным стеклом ,слегка надавливая до получения отпечатка. 2)Препараты-мазки: кусочек ткани растирают в фарфоровой ступе пестиком до образования гомогенной массы из которой сделают мазки на предметных стеклах. 3)культура клеток.После приготовления препаратов их высушивают на воздухе 20-30 мин. фиксируют в охлажденном ацетоне-4 градуса от 4 до 12 часов , 20 градусов -1 час, после чего извлекают из ацетона и еще раз высушивают на воздухе.Различают два основных метода применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой. Прямой метод (одноступенчатый). На фиксированный препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37 °С во влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанногоконъюгата физиологическим раствором (pH 7,2 — 7,5), подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом. Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку. Непрямой метод (двухступенчатый). На фиксированный препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °С, отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного — продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30 мин при 37 °С. Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом. Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами антивирусных антител. Так, если антивирусные антитела получали на кроликах, то используют флуоресцирующую антикроличью сыворотку. Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены различных вирусов, так как он основан на использовании антивидовых сывороток. Чаще применяют антикроличьи, антибычьи, антилошадиные сыворотки и сыворотки против глобулинов морской свинки. Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего внимания заслуживает метод с использованием комплемента. Метод заключается в том, что на фиксированный препарат наносят инактивированную нефлуоресцирующую специфическую сыворотку и комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, и для выявления комплекса антиген + антитело + комплемент наносят флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, подсушивают на воздухе и исследуют под люминесцентным микроскопом. Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней животных.

Мы поможем в написании ваших работ!