Куриные эмбрионы и их использование в вирусологии.
Методы заражения.Подготовка: овоскопия (жизнеспособность, подвижность плода, отмечают границы пуги, участок бессосудистой зоны, подлежание плода); заражают в асептич. условиях в кювете с мерлев. салфеской с дезр-ром; стерилиз. инструменты ставят в спирт и фломбируют при повторн. использовании. 1.В аллантоисную полость (вирус гриппа, ринопневмонии лошадей, везикул. стоматита). 1)овоскопия; 2)положение яйца пугой верх; 3)дезинфекция со стороны пуги; 4) крестообр. надпил со стороны пуги; 5)вируссод. материал ввести иглой на 2-3 мм ниже границы пуги в объеме 0,1-0,2 мл; 6)отверстие закрыть парафином; 6)метка, термостат. 2. На ХАО (оспа, чума, болезнь Ауэски). Через естеств. пугу: 1)-3)то же; 4)кавдр. отверстие со стороны пуги, снять подскорлуп. оболочку; 5)вируссод. материал ввести на ХАО шприцем или пипеткой; 6)-7) то же. Через искусств. пугу: 1) овоскопия; 2)положение горизонт. пугой вправо, плод –сверху; 3)дезинфекция на пуге и плоде; 4)со стороны пуги –кругл. отверстие, плода –квадр. отверстие, удалить подскорл. оболочку; отсосать грушей воздух из пуги, плод переместится, обазуется новая пуга сверху; 5)вируссод. материал ввести пипеткой на ХАО; 6)-7) тоже. 3.В желточн. мешок ( ринопневмония лошадей, болезнь Марека). 1)овоскопия; 2)положение либо горизонт., пугой вправо, плод вверху, либо верт., плод-внизу; 3)дезинфекция; 4)крестообр. надпил в первом случае над пугой, во втором – у желтка; 5) вируссод. материал ввести на 2-3 мм. 6)-7)то же. 4. В тело зародыша: 1)-4)то же, что и на ХАО; 5)раздвинуть ХАО пинцетом и вытащить зародыша, ввести вируссод. материал в него, опустить; 6)-7)то же. 1.Подбор: К/К должны быть чувствительны к вирусу, из клеток органа-мишени естественвосприимч. животного без признаков дегенерации; 2.Получение вируссод. материала (шпора№39); 4.Заражение К/К: 1)контактный метод: ротовую пит.среду смывают р-ром Хенкса, в пробирку вносят вируссод. материал (0,1-0,2 мл), распределяют покачиванием, в термостат (t=37, на 1-2ч), вируссод. материал удаляютпромывают р-ром Хенкса, наливают поддерж. пит. среду; 2)диффузный: заражают точечно, вирус из одной зараженной клетки дифундирует в другую; 5.Культивирование вируса в клетках: закрытые пробирки ставят в термостат (t=37) под углом в 5град (матрасы –горизонтально) в роллерах (вращаются).Для каждой пробы – 4-10 пробирок + 4-6 контрольные. При длит.культивировании среду меняют каждые 7 дней. Пробирки проверяют под микроскопом каждый день. 6.Индикация:ЦПД(округление, фрагментация, гибель), РГАд, цветная проба(если индикатор в поддерж. среде меняет цвет, то вируса в К/К нет – клетки продолжают жить, выделяя продукты обмена, смещающие рН в кисл. сторону), бляшкообразование (появляются обесцвеченные зоны погибших от вируса клеток), тельца-включения (свет. микроскопия), РИФ.
|
|
|
Культуры клеток и их использование в вирусологии.
|
|
|
Культура клеток (КК) –это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма. Методика культивирования особенно успешно стала развиваться после 40-х годов. Этому способствовали следующие события: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение КК, открытие Хангом и Эндерсом способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток. Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных КК. Применяют следующие КК: 1) ПТКК – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие invitro в один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. 2) Субкультуры – их часто используют и получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток формируется монослой. Они по чувствительности не уступают ПТКК, более экономичны. 3) Перевиваемые КК – клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. Влаборатория их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получают их из первичных КК с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом , стабильны в условиях роста invitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. «+» перед первичными – проще готовить, заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Но они склонны к злокачественному перерождению. 4)Диплоидные КК – морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования invitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся 3 фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Их тоже получают из первичных клеток. В отличие от них имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 -\+ 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Преимущества перед перевиваемыми КК – 10-12 дней могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. 5)Суспензионные КК – перевиваемые культуры клеток в суспензии.
|
|
|
|
|
|
53. Титрование вирусов. Понятие об инфекционных единицах локальных повреждение, 50%-ного действия, ГАЕ.
Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы. Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД50— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале. В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6. Иначе говоря:1 ЛД50—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей); 1 ИД50—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных; 1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов; 1 ЭИД50—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;1 ЦПД50— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=103,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103'48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 103,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток. Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию. Титрование вирусов по 50%-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов. Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам: во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 35), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД50, на значительном отрезке приближается к прямой. Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД50, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается; во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4—6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50%-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50%-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД50. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД50) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50%-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.
54. Серологические реакции используют с целью:
диагностики вирусных болезней. Во-первых, по известному антигену (диагностикуму) определяют в исследуемой сыворотке наличие и количественное содержание (титр) специфических к данному антигену антител. Во-вторых, с помощью известного антитела, т. е. диагностической иммунной сыворотки, определяют наличие в исследуемом материале специфического антигена и осуществляют его идентификацию; серологической оценки поствакцинального иммунитета. По уровню антител в сыворотках крови определяют напряженность гуморального иммунитета; изучения иммунологического фона среди поголовья животных. Наличие антител в сыворотках крови позволяет установить комбинацию возбудителей, циркулирующих в стаде, и напряженность иммунитета к ним. На основании полученных данных можно более эффективно проводить мероприятия; изучения антигенной структуры вирусов с помощью моновалентных сывороток к отдельным его компонентам; установления степени антигенного родства вирусов; оценки активности диагностических препаратов и вакцин; изучения патогенеза вирусных болезней. В вирусологии широко применяют следующие серологические реакции: реакцию нейтрализации (PH); реакцию торможения гемагглютинации (РТГА); реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА); реакцию торможения гемадсорбции (РТГАд); реакцию связывания комплемента (РСК); реакцию диффузионной преципитации (РДП); реакцию иммунофлуоресценции (РИФ); реакцию иммуноферментного анализа (ИФА). Они различаются между собой методом определения — образовался комплекс антиген + антитело или нет. В связи с этим и техника постановки каждой их них разная.
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 534; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!