Субъединичный состав РНК-полим. E.coli. Holo- и Core-ф-ты
РНК-полимераза Е.coli - белок с четвертичной структурой. Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул РНК-полимеразы.
Субъединичный состав фермента: 2α, ββ´σ - holo-фермент (полный фермент). Без σ -фактора это core-фермент (2 ) 2α, ββ´.
σ - фактор - сменный фактор специфичности.
Только holo-фермент обладает высоким сродством к специфической последовательности нуклеотидов - промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10000 раз. У core-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.
Сам по себе σ - фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору.
Как только произошла инициация транскрипции, σ -фактор отделяется. Элонгация - продолжение синтеза РНК, и терминация - его остановка, осуществляются core-ферментом.
Стадии узнавания и связывания, а также инициации осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом.
Две α субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы.
β´ - субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот.
В β - субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте.
|
|
|
Вопрос 22
Оперон
Оперон – единица транскрипции. В начале каждого оперона промотор. В конце – терминатор. М/ду ними – стр. гены, или цистроны. М/ду промотором и 1-м цистроном может находиться оператор. Оператор может преркрываться с промотором или даже целиком в нём находиться. Перед каждым из цистронов лидер.
Промотор – посл, узнаваемая holo-ф/том ДНК-зав. РНК-полимеразой как посадочная площадка и старт позиция.
Терминатор – посл, узнаваемая core-ф/том как сигнал прекращения синтеза. На нём происходит дисс. ф-та и ДНК.
Цистроны – посл, в каждой заодирована 1 пепт. цепь или 1 мол-ла РНК. В 1 опероне закодированы участники 1 б/х ре-ии.
Оператор – посл, узнаётся репрессором. Если р. сидит на операторе, а опрератор перекр. с промотором, то невозможна даже посладка РНК-пол. Если оператор за промотором, невозможно движение.
Перед каждым геном – ШД. Лидер нуженр для инициации.
Вопрос 23
Особенности стр. промоторов у прокариот
Для изучения структуры промоторов провели следующий эксперимент. При оптимальных условиях связывания получили комплекс РНК-полимеразы с ДНК. Этот комплекс обработали ДНК-азой, и таким образом гидролизовали всю ДНК, незащищенную РНК-полимеразой. После этого отделили РНК-полимеразу от оставшихся фрагментов ДНК. Опять создали оптимальные условия для образования комплекса. Комплекс не образовывался.
|
|
|
Отсюда следует вывод, что
узнавание и прочное связывание происходит на разных участках ДНК.
Эти участки отличаются и по первичной, и по вторичной структуре. Путем секвенирования выявили структуру многих промоторов. У большинства из них имеется общее свойство.
РНК-полимераза узнает промотор, покрывая 40-60 пар нуклеотидов. В промоторе узнается взаимное расположение двух расплавленных AT-богатых участков. В каждом из них расплавлено 4-6 пар. Центры этих участков находятся в положенях "-10" и "-35". Принципиально важным является расстояние между расплавленными участками. Оно колеблется от 16 до 19 п.н. Искусственное увеличение этого расстояния до 20 п.н. или уменьшение его до 15 п.н. приводит к тому, что РНК-полимераза не узнает испорченный промотор.
Вопрос 24
Этапы транскрипции у прокариот
Узнавание и прочное связывание
Как только произошло узнавание (позиция 1), РНК-полимераза перемещается в позицию 2. В каталитическом центре инициации транскрипции, находящемся в β -субъединице, оказывается +1-ый нуклеотид оперона. Переход из позиции 1 в позицию 2 возможен, если на операторе нет белка-репрессора.
|
|
|
Примерно 5% промоторов у прокариот имеют только участок "-10", однако, тем не менее, хорошо узнаются РНК-полимеразой. Такие промоторы представлены палиндромными последовательностями, принимающими форму креста при суперспирализации кольцевых молекул ДНК.
2. Инициациязаключается в образовании первой фосфодиэфирной связи между пурин-трифосфатом (АТФ или ГТФ) и следующим нуклеотидом. После инициации σ - фактор покидает фермент.
3. Элонгация- последовательное наращивание цепи РНК (или продолжение транскрипции).
Скорость элонгации 40-50 нукл./сек.
Для комплементарного синтеза РНК необходим разрыв водородных связей в ДНК. Core-фермент РНК- полимеразы покрывает примерно 40 пар нуклеотидов (4 витка спирали ДНК). Разрыв водородных связей на 4-х витках спирали - очень энергоемкий процесс. Он не был обнаружен при изучении транскрипции.
Показано, что РНК-полимераза переводит ДНК из В-формы в А-форму. В ней плоскости азотистых оснований не перпендикулярны оси спирали, а наклонены на 200 к перпендикуляру. Это облегчает "выворачивание" двух соседних азотистых оснований в цепи ДНК для того, чтобы напротив них встали комплементарные нуклеотиды РНК. В пользу этого говорит полная идентичность параметров А-формы ДНК и гибрида, состоящего из одной цепи ДНК и одной - РНК. "Мотором" транскрипции является энергия, высвобождающаяся при отщеплении пирофосфата от каждого рибо-НТФ.
|
|
|
Ингибиторы транскрипции прокариот.
Существует множество ингибиторов транскрипции. Они действуют по разным механизмам и на разных стадиях. Большинство из них - антибиотики.
Рифампицин - ингибитор инициации.
Связывается с центром инициации holo-РНК-полимеразы E. сoli.
Стрептолидигин - ингибитор элонгации.
Связывается с центром элонгации core-РНК-полимеразы E. сoli.
4. Терминация. Специфическая терминация бывает ρ - независимой и - зависимой.
При ρ - независимой терминации в терминаторе присутствует палиндром. В синтезируемой РНК формируется шпилька. Шпилька меняет конформацию РНК-полимеразы и фермент теряет сродство к ДНК.
ρ-зависимая терминация.
ρ - фактор - это имеющий четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью.
Он способен узнавать 5`-конец синтезируемой РНК длиной приблизительно 50 нуклеотидов, садиться на него и двигаться по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК.
В терминаторе много Г-Ц пар (с тремя водородными связями), вследствие чего РНК-полимераза замедляет ход, ρ - фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента - и синтез РНК прекращается.
Вопрос 26
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 857; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!