Насыщенный раствор аммония сернокислого
Содержимое пакета с реагентом 6 перенести в коническую колбу вместимостью 200 мл, растворить в 100 мл дистиллированной воды при кипячении. Полученный раствор выдержать в течение 12 часов при комнатной температуре и отфильтровать. Приготовленный раствор должен иметь рН 7,0-7,1, поэтому его следует подщелочить раствором аммиака,10 % осторожно добавляя его по каплям (~3 капли).
Насыщенный раствор сернокислого аммония можно хранить при комнатной температуре в течение года.
Проведение анализа
Определение цитоза
Спинномозговую жидкость тщательно размешать в течение 2 мин, затем смешать в смесителе для лейкоцитов с реактивом Самсона. До первой метки набрать реактив, до второй метки набрать спинномозговую жидкость. Смеситель встряхнуть и оставить на 10-15 мин для прокрашивания клеточных элементов. Если смесителя нет или жидкости очень мало, допускается смешивание спинномозговой жидкости с реактивом Самсона в соотношении: 10 капель СМЖ и 1 капля реактива.
Окрашенную жидкость интенсивно встряхнуть, вылить из смесителя первые 1-2 капли и затем заполнить счётную камеру. Наиболее удобна камера Фукса-Розенталя. Заполненную камеру оставить в горизонтальном положении на 1 мин для оседания клеточных элементов.
Определение общего белка (реакция Панди)
На предметное стекло налить 2 капли реактива Панди, сбоку поместить 1-2 капли спинномозговой жидкости, так чтобы обе жидкости слились, и через 2 минуты визуально на темном фоне учесть результаты реакции.
|
|
|
Количественное определение общего белка
Построение калибровочного графика
Калибровочный раствор общего белка,10 г/л разбавить раствором натрия хлористого, 9 г/л в следующих соотношениях:
Таблица 1
| № п/п | Калибровочный раствор общего белка, 10 г/л, мл | Раствор натрия хлористого, 9 г/л, мл | Концентрация общего белка, г/л |
| 1 | 0,05 | 4,95 | 0,1 |
| 2 | 0,20 | 4,80 | 0,4 |
| 3 | 0,30 | 4,70 | 0,6 |
| 4 | 0,50 | 4,50 | 1,0 |
| 5 | 0,75 | 4,25 | 1,5 |
Приготовить 5 пробирок вместимостью 10 мл. Во все пробирки внести по 5,0 мл реагента для количественного определения общего белка, в каждую пробирку добавить по 0,5 мл раствора общего белка с концентрацией 0,1 г/л, 0,4 г/л, 0,6 г/л, 1,0 г/л и 1,5 г/л, соответственно. Содержимое пробирок тщательно перемешать, выдержать при комнатной температуре (18-25) °С в течение 10 минут. Измерить оптическую плотность проб против раствора натрия хлористого, 9 г/л при длине волны 410 (400-480) нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см.
|
|
|
Построить калибровочный график, откладывая по оси ординат оптическую плотность проб, а по оси абсцисс – соответствующие им значения концентрации общего белка, указанные в графе 4 таблицы 1.
Количественное определение общего белка
Компоненты и анализируемые пробы отмерить в количествах, указанных в таблице 2. Таблица 2
| Отмерить, мл | Опытная проба | Контрольная (холостая) проба |
| Реагент для определения общего белка | 5,0 | |
| Спинномозговая жидкость | 0,5 | 0,5 |
| Натрий хлористый (9 г/л) | - | 5,0 |
Содержимое пробирок тщательно перемешать, выдержать при комнатной температуре (18-25) °С в течение 10 минут. Измерить оптическую плотность опытной (Еоп) пробы против контрольной (холостой) пробы при длине волны 410 (400-480) нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см.
Примечание: При стоянии образцов более 20 минут, возможно уменьшение значения оптической плотности за счет оседания части преципитата. Непосредственно перед измерением пробирку с опытной пробой тщательно встряхнуть.
|
|
|
При использовании кюветы меньшего объема расход реагентов может быть уменьшен при сохранении указанных выше соотношений.
При концентрациях белка более 1,5 г/л пробу следует развести в 2-3 раза раствором натрия хлористого, 9 г/л, повторить определение и полученный результат умножить на разведение.
Определение глобулинов (реакция Нонне – Апельта)
В пробирку внести 0,5 мл насыщенного раствора сернокислого аммония и 0,5 мл спинномозговой жидкости, перемешать. В контрольную (холостую) пробирку внести 1,0 мл воды. Через 2 минуты визуально учесть результаты реакции, сравнивая опытную и контроль-ную пробы на темном фоне. Помутнение спинномозговой жидкости через 3 минуты и более не учитывается.
Примечание: Реакция Панди осаждает такие белковые фракции, которые остаются неосажденными в реакции Нонне-Апельта, поэтому целесообразно ставить обе реакции одновременно.
8. Регистрация результатов
Подсчет клеток
Не меняя горизонтального положения, камеру поместить на столик микроскопа.
Подсчет клеток производить во всей сетке при малом увеличении микроскопа (окуляр 15х, объектив 8х). При очень большом количестве клеток допускается подсчет половины сетки с последующим умножением результатов на 2.
|
|
|
Определение общего белка (реакция Панди)
В области соприкосновения реактива и спинномозговой жидкости возникает помутнение, выраженность которого зависит от содержания белка.
Количественное определение общего белка
Длина волны: 410 (400-480) нм;
Длина оптического пути: 1,0 см;
Температура анализа: комнатная (18-25) оС;
Измерение: против холостой пробы.
Определение глобулинов (реакция Ноне-Апельта)
Результат (появление на границе белого кольца) определяют через 2 мин, затем жидкость встряхивают и отмечают интенсивность помутнения.
Учет результатов
Камера Фукса-Розенталя
Количество клеток в 1 мкл рассчитать по формуле (1):
т.е. приблизительно 
(1),
где А – количество клеток во всей камере;
3,2 – объем камеры, мкл;
11/10 – степень разведения спинномозговой жидкости реактивом Самсона.
Камеры Горяева
При использовании камеры Горяева для получения более точного результата необходимо считать не менее 3 камер, взяв затем среднее арифметическое значение.
Количество клеток в 1 мкл рассчитать по формуле (2):
или Х = А 
1,2 (2),
где А – количество клеток во всей камере;
0,9 – объем камеры, мкл;
11/10 – степень разведения спинномозговой жидкости реактивом Самсона.
Реакция Панди
Степень помутнения обозначить крестами: слабая опалесценция - (+), заметная опалесценция – (++), умеренное помутнение – (+++), значительное помутнение – (++++).
Количественное определение общего белка
Расчет провести по калибровочному графику.
Реакция Ноне-Апельта
Реакцию выразить плюсами (как в реакции Панди).
Условия хранения и эксплуатации набора
Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре (2-8) оС в течение всего срока годности. Допускается хранение при температуре до 25 оС не более 20 суток.
Срок годности набора – 1 год.
Реактив Самсона после вскрытия флакона можно хранить при температуре (2-8) оС в плотно закрытом флаконе не более 1 года.
Реактив Панди можно хранить при комнатной температуре (18-25) оС не более 1 года. При снижении температуры реактив мутнеет, при подогревании просветляется и становится пригодным к использованию.
Раствор сульфосалициловой кислоты,6 % можно хранить при комнатной температуре не более 1 года
Раствор натрия сернокислого, 14 % можно хранить при комнатной температуре не более 1 года
Насыщенный раствор аммония сернокислого можно хранить при комнатной температуре (18-25) оС не более 1 года.
Калибровочный раствор общего белка после вскрытия флакона можно хранить при температуре (2-8) оС в плотно закрытом флаконе не более 6 месяцев.
Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
По всем вопросам, возникшим в результате использования набора, просим обращаться к нашим представителям или непосредственно в фирму
по тел. (812) 458-44-50
НПФ "АБРИС+"
Россия, Санкт-Петербург, 196084, ул.Цветочная, д.16 БЦ «Осипофф», оф. 207
тел: 8-800-1000-422
Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 738; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!