Пояснения по поводу метода детекции ДНК в геле бромистым этидием
Задания
Практического тура заключительного этапа
XXXIV Всероссийской олимпиады школьников по биологии.
Уч. год, 11 класс
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА и ЭВОЛЮЦИЯ
Максимум 40 баллов, время выполнения задания 50 минут
Межвидовая гибридизация – один из механизмов видообразования эукариот. При этом полиплоидия характерна для многих групп животных и растений, в том числе позвоночных, однако не была обнаружена у млекопитающих. Для обнаружения случаев межвидовой гибридизации и полиплоидизации не обязательно секвенировать геномы, в полевых условиях гибридов можно находить при помощи амплификации видоспецифичной ДНК с помощью полимеразной ценой реакции (ПЦР) и электрофореза продуктов ПЦР в агарозном геле.
Вам нужно провести электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР с использованием ДНК трех известных видов животных: А, В и С, и животного Х, которое предположительно является межвидовым гибридом, а также ответить на вопросы, связанные с методами гель-электрофореза и ПЦР и биологией межвидовых гибридов и полиплоидных организмов.
Тщательно следуйте инструкции по подготовке образцов к электрофорезу, приведенной ниже! Заполненный образцами гель передайте преподавателю для проведения электрофореза, в обмен Вы получите фотографию готового геля с теми же образцами. Качество Вашего геля будет оценивать преподаватель.
Все ответы пишите на Листе Ответов!
Инструкция по подготовке образцов к электрофорезу
Уважаемый участник, на Вашем рабочем месте находится штатив с микропробирками, содержащими результаты ПЦР с видоспецифическими праймерами известных видов животных А, В, С и анализируемого вида Х, микропробирка с четырёхкратным окрашенным буфером для нанесений ДНК в гель (обозначена буквой Б), и микропробирка с окрашенным маркером молекулярных масс ДНК (обозначена буквой М). Кроме этого, Вам выданы чашка Петри, содержащая пронумерованный фрагмент агарозного геля, штатив с наконечниками для автоматической пипетки и автоматическая пипетка.
Выставленный рабочий объём пипетки виден в индикаторном окошке в верхней части пипетки и может изменяться от 2,0 до 20,0 микролитров. Рукоятка поршня пипетки имеет три положения: 1) ожидание (максимально выдвинута, в это положение пипетка переходит сама после того как Вы перестанете давить на рукоятку), 2) первый упор – набор/слив заданного рабочего значения (в первый упор пипетка переходит, если рукоятку аккуратно нажать пальцем), 3) второй упор – полный слив – выдувание объема, немного большего, чем заданный рабочий объём. Для того, что бы отмерить и перенести с помощью пипетки рабочий объём жидкости, выставьте этот объём регуляторным колёсиком, наденьте наконечник, нажмите рукоятку до первого упора, удерживая рукоятку в этом положении, погрузите кончик наконечника в отбираемую жидкость, отпустите рукоятку до положения ожидания. Рабочий объём жидкость войдёт в наконечник. Поместите кончик наконечника туда, куда вы хотите перенести жидкость, нажмите рукоятку до первого упора и удерживайте ее, пока жидкость не выйдет из наконечника. Поднимите пипетку так, чтобы кончик наконечника оказался в воздухе, отпустите рукоятку – в наконечник войдет воздух. Если отпустить рукоятку, не отрывая кончик наконечника от капли жидкости, жидкость снова войдет в наконечник. Этот приём можно использовать для перемешивания жидкости (так называемое пипетирование).
Напишите номер Вашего геля на Листе ответов в графе «Рабочее место (гель)». Возьмите пипетку в руку. Выставьте пипетку на рабочий объем 2 микролитра, вращая свободной рукой регуляторное колесико с резьбой в верхней части пипетки. Наденьте на пипетку наконечник, возьмите микропробирку с буфером для нанесения ДНК в гель, и нанесите на дно чашки Петри четыре капли буфера для нанесения, по 2 микролитра каждая, на расстоянии примерно 1 см друг от друга. Сбросьте наконечник из-под буфера в крышку от чашки Петри (мусорная зона).
Переведите пипетку на рабочий объем 6 микролитров, наденьте новый наконечник, отберите 6 микролитров окрашенного маркера молекулярных масс и внесите этот объём в первую лунку Вашего геля (верхняя левая, направление движения ДНК в геле сверху вниз). Сбросьте наконечник из-под маркера в крышку от чашки Петри.
Наденьте новый наконечник, отберите 6 микролитров реакционной смеси ПЦР образца А, добавьте в первую каплю буфера для нанесения, перемешайте жидкости, пипетируя их 4-5 раз до первого упора, переведите пипетку на рабочий объем 8 микролитров, осторожно вылейте реакционную смесь А вместе с буфером для нанесения во вторую лунку Вашего геля. Сбросьте наконечник из-под образца А в крышку от чашки Петри.
Повторите описанную выше процедуру для образца В (вторая капля, вносится в третью лунку), С (третья капля, в четвертую лунку) и Х (четвертая капля, в пятую лунку). Готовый гель отдайте преподавателю, получите у него фото геля после электрофореза. Переходите к теоретическим заданиям.
Пояснения по поводу метода детекции ДНК в геле бромистым этидием
Рассмотрите формулу и спектры возбуждения и флуоресценции ДНК-связывающего красителя бромистого этидия, которым обычно окрашивают гели для визуализации результатов электрофореза. Как вы считаете, с какими химическими группами в ДНК связывается этидий и каков механизм стабилизации комплексов ДНК-этидий? Свет каких «цветов» подходит для проявки окрашенных этидием гелей?
Дата добавления: 2018-06-27; просмотров: 597; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!