L’analyse des composants de la mucine de la salive.
LE TRAVAIL LABORATOIRE 1 «LA BIOCHIMIE DES PROTEINES»
Buts et objectifs: apprendre les méthodes de la détermination et de l’analyse des substances des objets biologiques, la composition et les propriétés des acides aminés et des protéines ; apprendre les méthodes chromatographiques des recherches, expliquer les possibilités de l’utilisation de ces méthodes en pratique médicale ; étudier la structure et les propriétés des protéines complexes ; étudier la technique de la détermination des composants protéiques et non protéiques des glycoprotéines.
L’étudiant doit:
- savoir: les règles de la technique de sécurité du travail dans le laboratoire de la chimie biologique; les méthodes essentielles de la détermination et de l’analyse des substances; la classification, la composition, les propriétés des acides aminés; la classification des protéines, de certains représentants des protéines simples et complexes, les types de liaisons entre le composant protéique et le groupement prosthétique dans les molécules des protéines complexes de différentes classes;
- savoir faire: réaliser l’analyse chromatographique du mélange des acides aminés, faire les calculs des coefficients de la distribution; réaliser l’analyse des composants des protéines complexes, prouver leur nature chimique;
- posséder: la technique des travaux laboratoires dans le laboratoire de la chimie biologique; les méthodes de la réalisation de la chromatographie sur couche mince; les méthodes de la détermination pratique de la nature chimique des protéines complexes; les méthodes de l’acquisition et de l’analyse des données de l’expérience.
Les protéines sont des substances organiques macromoléculaires contenant l’azote, leurs molécules se composent des résidus des acides α-aminés liés par des liaisons peptidiques. Les protéines représentent la base de la structure et des fonctions des organismes vivants.
Lors de l’hydrolyse des protéines sont formés les acides aminés. Toute la variété des protéines est déterminée par le contenu quntitatif et qualitatif de différents acides aminés, par la disposition mutuelle des résidus des acides aminés dans la molécule protéique.
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Les propriétés chimiques et physiques les plus caractéristiques pour les protéines sont la haute viscosité des solutions, la diffusion inconsidérables, la capacité du gonflement, l’activité optique, la mobilité dans le champ électrique, une basse pression osmotique et une haute pression oncotique. Les molécules de la protéine ne peuvent pas pénetrer à travers des membranes synthétiques semi-perméables et aussi à travers des biomembranes des tissus végétaux et animaux.
La dénaturation des protéines est un trouble de la structure de la molécule native de protéine qui provoque la perte des propriétés caractéristiques pour les protéines (la solubilité, l’activité biologique etc.). La dénaturation peut se dérouler sous l’influence des facteurs physiques et chimiques. En apparence elle se manifeste comme la perte de la solubilité, surtout au point isoélectrique.
Les protéines simplesse composent des résidus des acides aminés et lors de l’hydrolyse elles se décomposent seulement en acides aminés libres. Les protéines simples sont représentées par les protamines et les histones, par les prolamines et les glutélines, par les albumines et les globulines.
Les protéines complexes sont des protéines à deux composants qui se composent de quelque protéine simple et d’un composant non protéique. Selon la nature du composant non protéique on distingue des nucléoprotéines, des glycoprotéines, des lipoprotéines, des phosphoprotéines, des chromoprotéines, des métalloprotéines.
Les glycoprotéinessontdes protéines complexes qui se composent d’une protéine simple, des chaînes des hétérooligosaccharides (les résidus d’hexoses (le galactose et le mannose, plus rarement le glucose), des pentoses (le xylose, l’arabinose)) et de l’hydrate de carbone terminal qui est le plus souvent représenté par N-acétylgalactosamine , par L-fucose ou par l’acide sialique.
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Les glycoprotéines sont des récepteurs membranaires, des interphérones, des immunoglobulines, des protéines de plasma du sang, de lait, des facteurs du groupe sanguin etc. Les glycoprotéines assurent l’adhésion cellulaire, la reconnaissance moléculaire et cellulaire, l’activité antigènique, elles ont l’effet protecteur, hormonal et antiviral.
Les mucines du tube digestif sont des glycoprotéines dont la partie glucidique est représentée par les mucopolysaccharides. Elles protectent les muqueuses des influences chimiques, mechaniques, thermiques et de la digestion par des enzymes protéolitiques.
Les réactifs et l’équipement: les solutions d’ acides aminés 0,04 М; le mélange de butanol, d’acide acétique et d’eau (15:3:7); 0,5 % la solution de ninhydrine dans l’acétone; 10 % la solution d’hydroxyde de sodium ; 1 % la solution de sulfate de cuivre; 1 % la solution d’acide acétique; 1 % la solution alcoolique d’α-naphtol; l’acide sulfurique concentré; la salive; l’eau distillée; les plaques chromatographiques;les pipettes capillaires; le vase chromatographique avec le couvercle; les lampes à alcool; les baguettes en verre; les pipettes analitiques; le banc Kofler; la chambre de nébulisation; le pulvérisateur; les éprouvettes.
1. L’analyse qualitatif des mélanges d’acides aminés selon la méthode de la chromatographie sur couche mince.
On dessine la ligne avec le crayon à la distance de 2 cm de la marge de la plaque chromatographique. Sur cette ligne on marque 4 points à égale distance. On prend la solution de premier acide aminé à l’aide de la pipette. On touche la plaque avec l’extrémité de la pipette au point 1 et on verse la solution. On fait la même chose aux points 2, 3, 4 avec les solutions d’autres acides aminés et avec leur mélange, chauqe fois il faut utiliser une pipette propre.
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On met le chromatogramme dans le vase chromatographique au fond duquel on a versé le mélange de butanol, d’acide acétique et d’eau (15:3:7), le bord de la plaque doit être plongé dans le révélateur à 1 cm. On ferme le vase avec le couvercle et on y laisse le chromatogramme pour quelque temps, le révélateur avance de bas en haut à 10 cm. On tire le chromatogramme du vase, on marque la frontière du révélateur et on le sèche sur le banc Kofler. A l’aide du pulvérisateur dans la chambre de nébulisation on asperge le chromatogramme séché avec la solution de ninhydrine dans l’acétone (0,5 % ) jusqu’à l’abreuvage égal (sans traînées). Ensuite on met le chromatogramme sur le banc Kofler lors de la température 70 °С pour 15 min. Sur le chromatogramme les positions des acides aminés se manifestent sous forme de taches bleues violettes.
On peut identifier les acides aminés selon la valeur Rf (le rapport frontal ou facteur de rétention). Pour cela on mesure la distance passée par le révélateur de la ligne de départ jusqu’à la frontière du révélateur et aussi la distance du point de l’application de chaque acide aminé jusqu’au centre de la tache colorée formée pendant la réaction de ninhydrine. On détermine la valeur du rapport frontal (Rf) de chaque acide aminé en divisant la distance passée par l’acide aminé sur le chromatogramme sur la distance passée par le révélateur. On fait les mêmes calculations pour les acides aminés du mélange étudié. En comparant les valeurs de Rf des acides aminés-témoins et des acides aminés du mélange observé on fait la conclusion sur la nature des acides aminés dans la composition du mélange. Les acides aminés qui se trouvent au même niveau sont identiques.
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1. Dessinez le chromatogramme.
2. Calculez Rf pour toutes les substances. Comparez les valeurs.
Conclusion:
L’analyse des composants de la mucine de la salive.
2.1. La sécrétion de la mucine de la salive.
On met dans 2 éprouvettes 1 ml de salive et on y ajoute goutte à goutte la solution d’acide acétique (1%) jusqu’à l’apparition des caillots de mucine. On lave prudement avec l’eau le précipité de mucine dans les éprouvettes, en tenant le caillot à l’aide de la baguette.
2.2. Les réactions à la partie protéique (réaction de biuret).
Pour déterminer la protéine dans l’éprouvette avec le précipité de mucine on ajoute en mélangeant la solution d’hydroxyde de sodium (10 %) jusqu’à la dissolution du caillot et on fait la réaction de biuret.
Observations:
Conclusion:
2.3. La réaction au groupement glucidique (l’essai de naphtol).
Les glucides de la mucine sont déterminés par l’essai de naphtol (réaction de Pobédov et de Molisch). Sous influence de l’acide sulfurique on forme des hexoses l’hydroxyméthylfurfural. Lors de son interaction avec α-naphtol est formé le produit coloré de la condensation.
Dans la deuxième éprouvette avec le précipité de la mucine on ajoute 0,5 ml de solution alcoolique d’α-naphtol (1 %), on mélange et le long du bord de l’éprouvette on verse prudement 0,5 ml d’acide sulfurique concentré.
Observations:
Conclusion
Les questions de contrôle
1. Quelles sont les propriétés des acides aminés?
2. Donnez la définition de 4 niveaux de la structure des protéines. Quelles liaisons stabilisent-elles la structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire des protéines?
3. Qu’est-ce que c’est la dénaturation et la rénaturation des protéines? Quels agents provoquent-ils la dénaturation?
4. Donnez la définition du point isoélectrique et du point isoionique pour les acides aminés et pour les protéines.
5. Quelle est l’utilisation de la méthode de la chromatoraphie en médecine?
6. Comment utilise-t-on le phénomène de dénaturation et du relargage des protéines?
7. Pourquoi pour le foetus, pour l’embryon et pour le nouveau-né les phosphoprotéines ont-elles le rôle important?
8. En quoi consiste la différence des glycoprotéines et des protéoglycanes? Quels types de liaisons existent-ils entre les composants glucidiques et les protéines?
9. Pourquoi les glycoprotéines sont-elles moins sensibles à l’action des facteurs dénaturants que les protéines simples?
10. Regardez la structure et les fonctions de l’hémoglobine А.
11. Pourquoi l’hémoglobine de l’embryon et de l’adulte est-il lié différement avec l’oxygène?
12. Qu’est ce qui est mieux soluble dans l’eau: les acides nucléiques ou les nucléoprotéines? Pourquoi?
13. Quelles liaisons retiennent-elles les chaînes des polydésoxyribonucléotides dans la molécule bispirale d’ADN?
Дата добавления: 2018-05-12; просмотров: 297; Мы поможем в написании вашей работы! |
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