Методы контроля и идентификации (цитофизиологические, химические, биохимические, биологические) биомассы и препаратов, полученных методом клеточной биотехнологии
Контроль экспериментов с рекомбинантными ДНК.
Оценка рисков в биотехнологии- произведение вероятности нежелательных событий на степень тяжести последствий.
В США безопасность всех ГМО проверяют три федеральных органа: Министерство сельского хозяйства, агенство по охране окружающей среды, Комиссия по контролю продуктов питания и лекарственных средств. Главный показатель
Эффективности = гарантия безопасности/ быстроту внедрения
В 1976 г. Национальные институты здравоохранения, ведущее исследовательское ведомство США, выделяющее денежные средства на работы в области медицины и здравоохранения, разработали директиву, регламентирующую проведение экспериментов с рекомбинантными ДНК. В ней выдвигалось требование, чтобы в качестве хозяев для чужеродных ДНК использовались только микроорганизмы неспособные размножаться вне стен лаборатории и передавать свою ДНК другим микроорганизмам. К 1980 г. первоначальные директивы были пересмотрены в сторону смягчения требований, благодаря полученным экспериментальным данным. Было установлено, что штамм Е. coli K-12, чаще других использовавшийся в работах с рекомбинантными ДНК, не способен размножаться и длительное время существовать вне стен лаборатории. Было признано маловероятным появление патогенного организма, если используемый для клонирования ген не отвечает за патогенные свойства того организма, из которого он был выделен. После того, как требования к мерам безопасности для большинства рутинных экспериментов были смягчены, технология рекомбинантных ДНК стала быстро развиваться. Однако остались две важные проблемы:
|
|
|
1. Как контролировать производство и потребление пищевых продуктов, содержащих ГМО?
2. Как уследить за преднамеренным высвобождением ГМО в окружающую среду?
Третью возможную проблему удалось разрешить, когда контролирующие органы пришли к выводу, что лекарственные препараты, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК, аналогичны препаратам, полученным традиционными методами. Положение, согласно которому проверке на безопасность и эффективность должен подвергаться сам продукт, привело к одобрению лекарственных средств, вакцин, диагностических систем, полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК.
Контроль за производством и потреблением пищевых продуктов
Нет необходимости в разработке новых нормативных актов, регулирующих производство и потребление пищевых продуктов и пищевых компонентов, получаемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, т.к. любой нелицензированный пищевой продукт (независимо от способа его получения) и так должен пройти проверку на токсичность, чистоту и аллергенность. Если в результате генетических манипуляций состав утвержденных FDA пищевых продуктов изменяется, то компания-производитель, проверив такие продукты на безопасность, должна снабдить их специальным ярлыком, уведомляющим об отличии от традиционного продукта.
|
|
|
ХИМОЗИН
Чтобы упростить процедуру тестирования и снизить себестоимость продукта, при лицензировании учитывается сходство нового продукта с известным, который предполагается заменить на рынке. Например, FDA утвердила к применению фермент химозин, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК и предназначенный для производства сыров, хотя соответствующие испытания не были проведены в полном объеме. Химозин, один из ключевых ферментов сычуга жвачных животных, является сбраживающим молоко протеолитическим ферментом, который гидролизует к-казеин. Для обеспечения более дешевого способа получения химозина, кодирующий его ген клонировали и экспрессировали в Е. coli К-12. Готовы продукт был выделен из бактериальных клеток. Идентичность клонированного и природного генов химозина была подтверждена рестрикционным картированием, ДНК-гибридизацией и секвенированием ДНК. Было показано, что рекомбинантный химозин обладал такой же молекулярной массой, что и природный очищенный химозин теленка, и одинаковой с ним природной активностью.
|
|
|
Данные по безопасности химозина.
Было подтверждено, что конечный препарат, экстрагированный из бактериальных телец включения и прошедший этапы очистки, не загрязнен целыми бактериальными клетками и нуклеиновыми куслотами. Применяемый штамм Е. coli К-12 не токсичен и не патогене для человека. Результаты тестирования на животных не выявили побочных эффектов, не токсичен. Рекомбинантный химозин был разрешен для коммерческого использования.
ТРИПТОФАН
В течение 1989- 1990 гг в США отмечалось резкое увеличение встречаемости синдрома эозинофилии -миалгии (СЭМ). Это редкое заболевание характеризуется тяжелыми, изнурительными мышечными болями, может приводить к летальным исходам в результате спазма дыхательных путей. Большинство пациентов употребляли в качестве пищевой добавки аминокислоту триптофан. В ходе исследований обнаружилось, что все партии некачественного триптофана были получены с помощью штамма генетически трансформированных бактерий, для получения сверхпродукции триптофана. Компания сочла, что штамм идентичен предыдущему и не стала проводить исследования на безопасность продукта. Одна из стадий очистки изменилась, хотя все контрольные тесты остались прежними. Как показали результаты химического анализа продукт содержал метаболиты триптофана, в том числе 1-1' -этилен-бис(триптофан) (ЭБТ). Анализ на токсичность выявил способность ЭБТ вызывать патологические изменения у крыс, сходные с симптомами СЭМ, а также способность самого триптофана, хотя и в меньшей степени вызывать симптомы СЭМ. Как следствие L-триптофан был запрещен в США для употребления человеком.
|
|
|
БЫЧИЙ СОМАТОТРОПИН
Получение рекомбинантного бычьего соматотропина (БСТ), известного под названием гормона роста крупного рогатого скота. В 1930 гг было показано, что введение БСТ коровам в значительной степени повышает их удойность. Ген БСТ был клонирован в Е. coli K-12, затем синтезированный рекомбинантный БСТ выделен из бактериальных клеток и очищен. Удойность коров при введении рекомбинантного БСТ увеличилась на 25-30%. Экспериментальные данные подтвердили безопасность БСТ для человека. В 1994 г рекомбинантный БСТ был лицензирован в США для применения в молочной промышленности.
5. Оценка потенциальных экологических рисков, связанных с введением в окружающую среду трансгенных растений.
Основные проблема: Будут ли трансгены переносится от ТР к природным организмам?
Горизонтальный перенос генов (ГПГ) от ГМ - растений к бактериям, а от них - к другим растениям, животным и человеку за счет естественной трансформации, т.е. передачи ДНК от одного организма к другому. В царстве бактерий можно выделить три основных способа ГПГ: трансдукция, конъюгация, трансформация. При трансдукции фрагменты ДНК от бактерии-донора к реципиенту переносят бактериофаги. При конъюгации обмен генами происходит в результате контакта между клетками. Трансформация - это естественный захват бактерий чужеродной ДНК с последующей экспрессией генов этой ДНК. Единственным способом ГПГ от растений к бактериям в природе оказывается именно трансформация. Вероятность ГПГ от растений к бактериям зависит от ряда факторов, которые должны совпасть, чтобы этот перенос произошел в естественной экосистеме:
· Выход неповрежденной ДНК в окружающую среду;
· Ее адсорбция частицами почвы для защиты от разрушения ферментами;
· Наличие пригодных для трансформации видов бактерий;
· Эффективное поглощение ДНК на поверхности бактериальных клеток;
· Эффективный перенос ДНК в эти клетки;
· Интеграция чужеродной ДНК в геном бактерии-реципиента;
· Экспрессия генов введенной ДНК в клетке-реципиенте.
Не удалось наблюдать ГПГ от ГМ-растений в природных условиях. В лабораторной практике вероятность ГПГ от растений к бактериям ничтожно мала 10 -15, 10-20
В международной практике для получения разрешения на полевые испытания ТР требуется предоставить данные:
· О стабильности, интеграции трансгена в хромосомах (8-10 лет);
· Об отсутствии патогенности трансгена для животных и человека;
· Об отсутствии токсичности для не целевых организмов (к инсектицидным ТР);
· О низком риске, что наличие трансгена может привести к образованию новых фитопатогенных вирусов.
Для коммерческого использования ТР:
· Конструкция трансгенной вставки, влияние на биологию ТР;
· Влияние ТР на экосистемы;
· О возможном самопроизвольном переносе трансгена в другие растения.
Для снижения риска распространения целевых насекомых, устойчивых к ТР разработана стратегия сдерживания распространения мутантов - возделывание между ТР островов не ТР.
Базовые, фундаментальные работы выполнены в середине 1980 гг. Более 10 лет проводились полевые испытания, и в 1997 г. ГМ-растения начали возделывать в коммерческих целях. Всего через пять лет площадь под ними приблизилась к 60 млн. га. К концу 2002 г. в мире около 20% площадей под кукурузой, масличным рапсом, соей и хлопчатником занимали ГМ-сорта. Выращивать ГМ-хлопчатник решила и Индия.
Сегодня в генной инженерии растений все шире используются новые подходы. Это электрофорез, капиллярная, жидкостная и газовая хроматография, связанные с масс-спектроскопией и другие методы, дающие информацию о концентрации метаболитов и метаболических путях в одном органе и даже клетке.
Трансгенные микроорганизмы
Опасность - вероятность горизонтального переноса трансгенов в природные штаммы. Предоставляется информация:
· о потенциальной патогенности ТМ
· выживаемости ТМ в окружающей среде
· влияние на структуру микробного сообщества
· о возможных путях распространения ТМ
7. Организация системы тестирования и проблема надежности методов
контроля генетически модифицированных источников (ГМИ/ГМО) Контроль трансгенных растений осуществляется на этапах посева, сбора урожая, транспортировании, хранении и переработки. В нашей стране не возделывают трансгенные растения. Следовательно, контроль необходим на этапах транспортирования, хранения и переработки. Основные методы контроля: ДНК-диагностика, иммунобиологические методы и хроматографические методы.
Этапы диагностики ГМИ
· Скрининговая диагностика. Для проведения необходимо использовать стандартные образцы, проводить калибровку и оценку адекватности результатов метода.
· Идентификация ГМИ в продукте. В мире около 300 трансгенных организмов.
Количественное измерение ГМИ. Используют ПЦР и иммуноферментный анализ. На основании данных количественного анализа принимается решение о маркировке ГМИ.
Таблица 12
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 2077; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!