Эйкозаноиды (простаноиды) и их биологическая роль. Арахидоновая кислота и другие полиненасыщенные кислоты как исходный продукт для получения простагландинов
Генетические маркеры. Методы идентификации и изоляции клонов с рекомбинантной ДНК. Скрининг. В основе скрининга лежит тотальная проверка полученных клонов. Отобрав наиболее продуктивные клоны, повторяют обработку тем же или другим мутагеном, вновь отбирают наиболее продуктивный вариант и т.д., т.е. здесь речь идет о ступенчатом отборе по интересующему признаку. Скрининг веществ с целью обнаружения медикаментов так же стар, как и сама медицина. Практически все антибиотики были найдены в результате испытания супернатана (осадочной жидкости) посевов микроорганизмов на наличие веществ, которые могут тормозить рост патогенных микроорганизмов. Современные полусинтетические антибиотики являются результатом химической модификации базового вещества, полученного с применением биотехнологии. При оптимизации любого промышленного процесса, протекающего с участием живых организмов, основные усилия бывают направлены на улучшение генетически обусловленных свойств. Традиционно для повышения продуктивности штаммов используют мутагенез с последующим скринингом и отбором подходящих вариантов. В прошлом для увеличения продуктивности штаммов обычно использовали мутагенез и отбор: именно таким путем удалось повысить выход антибиотиков, синтезируемых грибами и актиномицетами. Было последовательно отобрано свыше 20 штаммов, продуцирующих все больше пенициллина, и, в конечном счете, продуктивность увеличилась в 55 раз. Как в этом случае, так и во многих других отбора не происходило, поскольку не удавалось создать условия, при которых росли бы только искомые штаммы. Вместо этого пришлось применять метод скрининга: клетки, выжившие после воздействия больших доз мутагенов, размножали в колбах на качалках, после чего в фильтратах культуральной жидкости определяли количество антибиотика. Скрининг требует много времени и напряженного труда, т.е. скрининг – трудоемкий метод. Часто штаммы, для которых был получен большой выход при выращивании в колбах, оказывались непродуктивными в условиях роста в ферментере большого объема. Нередко успеху способствовалознание «секретов мастерства»: так, оказывается, что большая продуктивность обычно свойственна особым морфологическим вариантам. Недостатком метода также является отсутствие сведений о характере мутаций, исследователь проводит отбор по конечному результату. Так, если речь идет о штаммах бактерий, устойчивых к тяжелым металлам, то устойчивость может быть обусловлена мутациями разных типов: а) подавлением системы поглощения катионов металлов бактериальной клеткой; б) активацией выброса поглощенных катионов из клетки; в) перестройкой систем, чувствительных к ингибирующему действию тяжелых металлов. Шанс на удачу при «скрининге наугад» исключительно низок. Поэтому разработаны методы скрининга, открывающие исключительно большие возможности. Обнаружение хорошего «ведущего состава» возможно с помощью простых, быстрых и селективных методов определения («сито»). Метод может представлять собой чаще всего автоматизированный тест, который позволяет легко установить, связывается ли вещество из библиотеки веществ с клонированным человеческим рецептором или энзимом. После того как вещество отобрано, должно быть установлено, обладает ли оно и если да, то в какой степени, антагонистической или агонистической активностью. Для этого могут быть проведены функциональные испытания, с помощью которых, например, может быть установлено, ведет ли связывание лиганда с рецептором к передаче сигнала. При современных биотехнологических методах скрининга все чаще используются клетки, в которых клонированный рецептор или энзим сцепляется с простой для определения системой считывания. Так, получены клетки, которые начинают расти или изменять цвет или форму только после стимуляции клонированного рецептора. Подобные методы позволяют проверить ежегодно многие тысячи веществ на наличие желаемых биологических свойств. Скрининг с использованием чашек с агаром вместо колб на качалках позволяет обследовать гораздо больше мутантов. Образование антибиотиков или метаболитов нередко оценивается методом биологических проб, когда в агар вводят индикаторные организмы. Разработаны устройства для автоматического скрининга чашек. В них используются механические приспособления для инокуляции, и производится периодическое фотографирование и последующий компьютерный анализ изображений. Можно создавать особые условия, при которых мутанты с нужными свойствами не растут. В этом случае применяется так называемый метод обогащения, когда активно растущие клетки дикого типа погибают, а не растущие мутантные выживают. Так, например, пенициллин или нистатин вызывает гибель растущих клеток бактерий или грибов соответственно. При работе с грибами недостаток в среде инозитола приводит к автолизу растущих, но не покоящихся клеток. Наиболее подходящим способом является, конечно, прямой отбор, когда создаются условия для роста только мутантных клеток. Этот подход применялся для выделения штаммов – сверхпродуцентов некоторых метаболитов, например аминокислот и цитрата. Обработанную мутагеном культуру выращивают в присутствии ингибитора (например, аналога аминокислоты), в результате чего отбираются мутанты, преодолевающие нарушение обмена за счет образования избытка желаемого соединения. Отбор на чашках с агаром основан на том, что часть организмов отвечает на воздействия по принципу «все или ничего». Колонии мутантов растут, а диких клеток – нет. Однако при получении промышленных штаммов, особенно предназначенных для использования в длительных процессах ферментации, нередко стремятся получить для конкретных условий относительно небольшие различия в скорости роста. В этом случае отбор происходит при непрерывном культивировании. В хемостатах при длительном выращивании культура все время находится в экспоненциальной фазе роста, и это позволяет выделять даже те мутанты, у которых сродство к субстрату, удельная скорость роста или устойчивость к токсическому действию высоких концентраций субстрата или продукта лишь немного превышает исходный уровень. Биотехнология Воронин с.31-43
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Эйкозаноиды (простаноиды) и их биологическая роль. Арахидоновая кислота и другие полиненасыщенные кислоты как исходный продукт для получения простагландинов.
лист
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 298; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!