Проведение иммунохимического пнализа

Примером проведения такого анализа может служить хорошо Вам известная реакция

гемагглютинации, когда взаимодействие белковых антигенов с антителами вызывает

их осаждение, то есть преципитацию. Это только качественный или

полуколичественный метод.

Проблема установления концентрации антигена решается на основе конкурентного

связывания антителами меченного и немеченого антигена, что обусловило,

(определило) широкое практическое применение этого принципа.

Итак, иммуноферментный анализ применяется в том случае, если можно:

1. получать специфические антитела,

2. получить высокоочищенные антигены,

3. ввести метку, «маркер» в исследуемое вещество,

4. разделить связанные и свободные компоненты реакции,

5. выбрать метод определения концентрации «маркера»,

6. оптимизировать и стандартизовать условия проведения анализа.

 

В качестве «маркеров» применяются

 

1. радиоактивные метки (это радиоиммунный анализ (РИА, с

использованием радиоактивных атомов – тритий, радиоактивный иод и

другие).

2. ферментные метки (если ферменты стабильны, активны и действуют в

минимальных концентрациях). Суть: субстрат превращается в продукт и

далее обнаруживается фотометрическим методом.

3. Субстратные метки (АТФ и НАД), которые «пришиваются» к молекуле

антигена через адениновый остаток и сохраняют способность

взаимодействия с ферментом.

 

Для введения ферментативной метки применяются химические, биохимические,

иммунологические способы.

 

Основные методы иммуноферментного анализа.

- конкурентные на твердой фазе, суть которых заключается в том, что

заданное количество антител конкурентно взаимодействует со

смесью неизвестного количества измеряемого вещества и

постоянного количества этого же вещества, связанного с какой-либо

меткой. После завершения иммунохимической реакции измеряют

количество метки, связанной с антителами, используя

калибровочные графики.

- иммунометрические по принципу «сэндвич»-анализ, когда на

твердой фазе иммобилизуют избыток антител, с которыми проводят

инкубацию антигена. После удаления несвязавшихся компонентов

(антигена) в систему добавляют избыток меченых антител, которые

взаимодействуют с антигеном. Чувствительность и точность этого

метода выше, чем конкурентных методом. Для сокращения времени

анализа и повышения избирательности детекции антигена

используют моноклональные антитела, так как они весьма

специфичны.

- кинетические, принципы те же, но делают измерения в

кинетическом

режиме для ускорения анализа с использованием программного

управления. Это позволяет повысить чувствительность и точность

анализа.

 

Применение ИФА.

1. В диагностике микробных и вирусных возбудителей.

2. В диагностике неинфекционных болезней (диабет, рак, сердечно-

сосудистые заболевания.

3. Для контроля (мониторинга) лекарственной терапии (различных

психотропных лекарственных препаратов, препаратов, влияющих на

сердечно-сосудистую систему и других)

4. Для выявления отравления наркотиками, для выявления допинговых

препаратов в организме человека

5. В контроле технологических процессов, в определении качества

биотехнологической продукции в микробиологических производствах:

5.1.Для быстрого выявления высокоэффективных микроорганизмов –

продуцентов ферментов, антибиотиков и других веществ

5.2.Для контроля наличия посторонних микроорганизмов и

бактериофагов в ферментерах

5.3.Для определения степени загрязненности воздуха

5.4.Для обнаружения в донорской крови вируса гепатита В

5.5.Для определения белковых примесей в препарате инсулина.

Помимо медицинской практики методы иммуноферментного анализа

применяются в ветеринарии и сельском хозяйстве, особенно в

растениеводстве.

 

Моноклоналъные антитела

Системы ДНК-диагностики

В основе многих быстрых и надежных диаг­ностических методов лежит процесс гибридизация нук­леиновых кислот - спаривание двух компле­ментарных одноцепочечных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следую­щем.

1. Разрушение биологического образца (клетки, ткани), выделение молекул ДНК 

и их разрушение до одноцепочечных фрагментов.

2. Фиксация одноцепочечной ДНК - мишени на твердой подложке, например

мембранном фильтре или на поверхности лунки.

3. Обработка подложки раствором, содержащим меченые одноцепочечные

молекулы ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и рН раствора) спаривается с ДНК-мишенью.

4. Промывка фильтра для удаления избытка несвязавшихся молекул ДНК-зонда.

5. Детекция гибридных молекул ДНК-зонд/мишень.

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевы­ми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в выс­шей степени специфичной и высокочувстви­тельной.

Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образ­цы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК-мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности-мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифицировать (увеличить,наработать) с помошью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Получены и охарактеризованы более 100 раз­личных ДНК-зондов, позволяющих обнаружи­вать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. Так, име­ются зонды для диагностики бактериальных ин­фекций человека, вызываемых Legionella pneumophila(респираторные заболевания), Salmonellatyphi (пищевые отравления), Campylobacter hyoin-testinalis(гастриты), а также для выявления энтеротоксичного штамма Escherichia coli(гастроэн­териты). Однако это лишь «верхушка айсберга»; в принципе с помощью гибридизации можно вы­являть практически любые патогенные микроор­ганизмы.

 

Примеры ДНК-диагностики

Диагностика малярии

В качестве примера использования ДНК-зондов для диагностики заболеваний можно привести процедуру обнаружения Plasmodium falciparum.Этот паразит вызывает малярию, заболевание, угрожающее примерно трети всего населения Земли. Он инфицирует эритроциты и разрушает их, что приводит к развитию лихорадки, а в тя­желых случаях — к поражению мозга, почек и других органов. Чтобы выявить источники ин­фекции, оценить эффективность мер по их лик­видации и обеспечить раннюю диагностику и лечение, необходимы достаточно чувствитель­ные, простые и недорогие методы. В настоящее время малярию диагностируют с помощью мик­роскопического исследования мазков крови - эффективного, но трудоемкого и занимающего много времени процесса. Иммунологические методы обнаружения Plasmodium, такие как ELISA, достаточно быстрые и их легко автома­тизировать, но с их помощью нельзя отличить текущую инфекцию от прошедшей, поскольку при этом определяется только наличие антител к Plasmodiumв крови больных.

 

---

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 422; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!