Вопрос 88. Реакция неитрализации токсина антитоксином

В основе этой реакции лежит способность специфической ан­титоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин.
Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувст­вительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией.
Реакцию нейтрализации(РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микро­организмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализу­ющем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о спе­цифичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.
Для прове­дения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свин­кам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследу­емого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сыво­роткой, животные опытной группы останутся живыми. Конт­рольные животные погибнут в результате действия экзотоксина

Вопрос 89. Прямая и непрямая реакция флуоресценции

Молекулы иммуноглобулинов способны необратимо связываться (метиться) с некоторыми химическими веществами без потери своей антительной специ­фичности и свойства связываться с антигеном. Для такого мечения можно ис­пользовать красители, флуоресцирующие при облучении их коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим), например изотиоционат флуоресцеина, дающий зеленовато-желтое окрашивание, или другие флуорохромы. Использование для обнаружения антигенов меченных флуорохромами антител, т. е. реакцию иммунофлуоресценции (РИФ), предложил в 1950 г. А. Куне. С по­мощью РИФ можно быстро обнаруживать даже ничтожные количества антиге­нов, в том числе бактериальных и вирусных, по эффекту флуоресценции ком­плекса антиген + антитело в люминесцентном микроскопе.

Метод иммунофлуоресценции используют в двух вариантах. Один из них полу­чил название прямого метода РИФ, и в этом случае метят антитела, которые не­посредственно участвуют в реакции с исследуемым антигеном. Второй вариант известен под названием непрямого метода РИФ. В этом случае с исследуемым антигеном вначале взаимодействуют специфические к нему антитела, а уже с ни­ми взаимодействуют антивидовые антитела (антитела против иммуноглобули­нов диагностической сыворотки), меченные флуорохромом (рис. 74). Преиму­ществом непрямого метода РИФ является то, что при его использовании отпадает необходимость иметь большой набор различных специфических флуоресцирую­щих антител, так как он основан на использовании антиглобулиновых антител. В качестве последних обычно используют сыворотку козы или барана, иммунизи­рованных сывороткой кролика (коммерческие диагностические иммунные сыворотки чаще всего готовят путем иммунизации кроликов). Непрямой метод иммунофлуо­ресценции применяют не только для ускоренного обнаружения антигенов (воз­будителя), но и для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Напри­мер, для серологической диагностики токсоплазмоза токсоплазмы фиксируют на предметном стекле и обрабатывают сывороткой исследуемого больного. После ее отмывки мазок повторно обрабатывают сывороткой, содержащей меченные флуорохромом антитела против человеческого глобулина. Если в крови больно­го есть антитела, т. е. человек болен, в люминесцентный микроскоп будут видны светящиеся токсоплазмы.

Вопрос 90. Иммуноферментный анализ.

В основе методов иммуносорбентного анализа твердой фазы лежит сорбция анти­тел (для обнаружения неизвестного антигена) или антигенов (для обнаружения специ­фических антител) и специфических антител, меченных ферментом (иммунофермент- ный метод — ИФМ) или изотопом (радиоиммунный метод — РИМ). Чувствительность этих методов значительно превышает чувствительность традиционных иммунологиче­ских реакций, поэтому они приобрели самое широкое распространение. Эти методы могут быть использованы для диагностики практически любого инфекционного забо­левания. С их помощью можно определить как антигены любого возбудителя, так и ан­титела к ним. Методика постановки этих реакций включает три последовательных этапа.

Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ

Первый этап — адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве ^к°торой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхно-

лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связы­ваются со стенками лунок, у них сохраняются свободными активные центры, и по­этому они способны специфически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап — связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело + антиген, происходящей на границе твердая фаза—жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.

Третий этап - обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело + антиген специфическими антителами против данного антигена, но мечен­ными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к ан­тигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фа­зы формируется комплекс: антитело + антиген + меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антите­ла метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит Н₂0₂ в смеси с ортофенилендиамином, используемые в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку рас­твора субстрата приводит к тому, что он подвергается действию пероксидазы, фиксиро­ванной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интен­сивность которой может быть определена путем фотометрирования.

Радиоиммунный метод (РИМ) предусматривает использование антител, мечен­ных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоак­тивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактив­ности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицательных образцов

Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ

Для обнаружения антител реакции также ставят в три этапа. Первый этап — адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т. е. на их дне и стенках антигены уже адсорбированы.

---

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 480; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!