Вопрос 85. Реакция пассивной гемагглютинации
Классическая реакция агглютинации предусматривает использование корпускулярных антигенов. Однако в ней могут участвовать и растворимые антигены. Чтобы это стало возможным, такие антигены адсорбируют на иммунологически инертных частицах. В качестве носителя можно использовать частицы латекса или бентонита, однако в настоящее время наиболее часто применяют эритроциты животных или человека, улучшая их адсорбирующие свойства обработкой растворами танина, формалина или бензидина. Эритроциты, адсорбировавшие на себе антиген, называются сенсибилизированными данным антигеном, а иммунная реакция, в которой они участвуют, — реакцией непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА, или РПГА), так как эритроциты участвуют в ней пассивно.
РПГА ставят в специальных полистироловых пластинках с луночками, имеющими полусферическое дно. При использовании ее для серологической диагностики в этих луночках готовят двукратные разведения в физиологическом растворе исследуемой сыворотки и затем добавляют к ней в качестве диагностикума взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Учет результатов проводят через 2 ч инкубации при температуре 37 °С по четырехкрестной системе. При положительной реакции агглютинировавшиеся эритроциты оседают на дно луночки и равномерно покрывают его в виде перевернутого зонтика. При отрицательной реакции эритроциты тоже оседают, жидкость становится прозрачной, осадок выглядит как маленький диск в центре луночки. Титром сыворотки в РПГА считается последнее ее разведение, которое еще дает ярко выраженную гемагглютинацию без значительных признаков наличия диска.
|
|
|
РПГА может применяться также в качестве ускоренного метода бактериологической диагностики для обнаружения непосредственно в исследуемом материале неизвестных бактерий, вирусов, токсинов, например возбудителей чумы, стафилококковых энтеротоксинов и др. При таком варианте постановки РПГА в роли известного компонента реакции используют эритроциты, адсорбировавшие антитела известной специфичности — антительный эритроцитарный диагностикум. Если исследуемый материал содержит достаточное количество известного антигена, РПГА будет положительна.
Вариантами использования РПГА являются: реакция нейтрализации антигена (РНАг), реакция нейтрализации антител (РНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используют антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаимно контролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с антигенным диагностикумом и РНАг с антительным эритроцитарным диагности- кумом.
|
|
|
Реакция нейтрализации антител (РНАт) заключается в том, что суспензию, содержащую искомый антиген, смешивают со специфической иммунной сывороткой, содержащей известные антитела, в соответствующих объемах и инкубируют при температуре 37 °С в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 3—4 ч и окончательно — через 18—24 ч. Если в исследуемом материале имеется антиген, он свяжет антитела (нейтрализует их), и поэтому гемагглютинации не произойдет.
По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации антигена (РНАг). Только в этом случае в исследуемом материале обнаруживают антитела. Специфический антиген, добавленный к такому исследуемому материалу, будет связываться с антителами, содержащимися в нем, т. е. произойдет нейтрализация антигена антителами, и поэтому гемагглютинации при добавлении антительного эритроцитарного диа- гностикума не произойдет.
Вопрос 86. Реакция преципитации.
Реакции агглютинации и преципитации очень близки по своей сути. Различия между ними зависят главным образом от величины частиц антигена. Преципитацией называют процесс, когда происходит агрегация антител с растворимыми антигенами; если же антиген представлен корпускулами, специфическая агрегация таких антигенов описывается как агглютинация.
|
|
|
Появление преципитата при реакции антиген—антитело определяется не только возникновением решетки, образуемой ее участниками, но и особой ролью Fc-фрагмента иммуноглобулина, изменение конформации которого приводит к утрате этим комплексом растворимости в солевых растворах. В связи с этим в реакции преципитации используют неразведенную или слабо разведенную сыворотку.
Для постановки реакции преципитации необходимы: антитела — испытуемая сыворотка больного или иммунная диагностическая сыворотка (при идентификации выделенных микробов); антиген — экстрагированный гаптен или полный гаптен соответствующих микроорганизмов; физиологический раствор как источник электролитов. Существует множество модификаций этой реакции, которые подразделяют на две группы: преципитация в жидкой среде (реакция флоккуляции и реакция коль- цепреципитации) и преципитация в геле.
Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой растворы антигенов и антител смешивают в пробирке. Учет реакции производят с помощью измерения на фотоэлектроколориметре мутности получаемой системы, что позволяет определить концентрацию исследуемого антигена.
|
|
|
Значительно чаще применяется качественная реакция кольцепреципита- ции. Для ее постановки в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху на нее наслаивают, не допуская перемешивания, раствор антигена. В случае гомологичности антител и антигена на границе между этими растворами быстро, через 3—10 мин, появляется кольцо преципитата. В отличие от реакции агглютинации, титр преципитирующей сыворотки определяют с помощью разведения не сыворотки, а антигена.
Реакция преципитации в геле является одним из наиболее эффективных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости и провести анализ их антигенного родства. В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в геле, а другой — антиген — наслаивается на первый в виде раствора. Антиген, диффундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хорошо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще более простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследовании перекрестных реакций (рис. 73).
Для постановки реакции по Оухтерлоню используют 1 %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5—6 мм — одна в центре чашки, 4—5 — по окружности на расстоянии 1—2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагностическую преципитирующую сыворотку, а в периферические — раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной температуре. Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где создаются их эквивалентные концентрации, образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных (см. рис. 73).
Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектро- форез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения. Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагностическим методом.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 302; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!