Методы изучения антибиотикочувствительности
Метод бумажных дисков (диско-дуффузионный)
Методика.Бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в чашку Петри.На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посев инкубируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста бактерий определяют ее чувствительность к антибиотикам.
Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов.
Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность методом серийных разведений.
Оценка результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методами дисков и серийных разведений
| Антибиотик | Метод дисков: диаметры зон задержки роста на среде АГВ (агар Гурьева-Васильева) | Метод серийных разведений: минимальная ингибирующая концентрация мкг/мл | |||
| Устойчивые | Умеренно устойчивые | Чувстви- тельные | Устойчивые | Чувстви- тельные | |
| Бензилпенициллин | ≤ 20 | 21-28 | ≥ 29 | - | ≤ 0.1 |
| Ампициллин | ≤ 20 | 21-28 | ≥ 29 | - | ≤ 0.2 |
| Карбенициллин | ≤ 14 | 15-18 | ≥ 19 | ≥ 32 | ≤ 16 |
| Метициллин | ≤ 13 | 14-18 | ≥ 19 | - | ≤ 3 |
| Оксациллин | ≤ 15 | 16-19 | ≥ 20 | - | ≤ 3 |
| Цефалексин | - | - | - | ≥ 32 | ≤ 10 |
| Цефалотин | ≤ 14 | 15-18 | ≥ 19 | ≥ 32 | ≤ 10 |
| Стрептомицин | ≤ 16 | 17-19 | ≥ 20 | ≥ 15 | ≤ 6 |
| Неомицин | ≤ 12 | 13-16 | ≥ 17 | - | ≤ 10 |
| Канамицин | ≤ 14 | 15-18 | ≥ 19 | ≥ 25 | ≤ 6 |
| Мономицин | ≤ 13 | 14-17 | ≥ 18 | - | ≤ 10 |
| Гентамицин | ≤15 | ≥ 16 | ≥ 6 | ≤ 4 | |
| Тетрациклин | ≤ 16 | 17-20 | ≥ 22 | ≥ 12 | ≤ 2 |
| Эритромицин | ≤ 17 | 18-21 | ≥ 22 | ≥ 8 | ≤ 2 |
| Линкомицин | ≤ 19 | 20-23 | ≥ 24 | ≥ 8 | ≤ 2 |
| Левомицетин | ≤ 15 | 16-18 | ≥ 19 | ≥ 16 | ≤ 8 |
| Рифампицин | ≤ 12 | 13-15 | ≥ 16 | ≥ 8 | ≤ 2 |
| Полимиксин | ≤ 11 | 12-14 | ≥ 15 | ≥ 50 Ед/мл | - |
| Ристомицин | ≤ 9 | 10-11 | ≥ 12 | - | ≤ 5 |
Метод серийных разведений
|
|
|
Данным методом определяют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) антибиотика рост исследуемой культуры бактерий.
|
|
|
Методика. Готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждомуразведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106-107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульонаи 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37°С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации антибиотика.Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по таблице, которая содержит значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.
Кчувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.
|
|
|
| Номер пробирки | Разведение антибиотика | Концентрация антибиотика, мкг/мл | Исследуемая культура, мл | Рост бактерий (помутнение среды) |
| 1 | 1:100 | 100 | 0,1 | - |
| 2 | 1:200 | 50 | 0,1 | - |
| 3 | 1:400 | 25 | 0,1 | - |
| 4 | 1:800 | 12,5 | 0,1 | - |
| 5 | 1:1600 | 6,25 | 0,1 | + |
| 6 | 1:3200 | 3,12 | 0,1 | + |
| 7 | 1 мл бульона без антибиотика | 0,1 | + (контроль) | |
Схема описания антибиотиков
Название препарата ………………….
Классификационное положение:антибиотик
Действующее начало: антибиотик (механизм действия на микробную клетку)
Получение: путем биосинтеза
полусинтетические
путем химического синтеза
Применение: лечение инфекций
Способ применения: перорально; парентерально; местное применение
|
|
|
К работе № 3
Плазмиды. Распространенность. Методы выявления
У бактерий имеется одна замкнутая кольцевая хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, т. е. бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением. Обычная бактериальная хромосома имеет молекулярную массу около 1010 Д (5х106 пар оснований; размер генома человека составляет 2,9х109 пар оснований). Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии, впервые установленная методом радиоавтографии, для клеток E.coli составляет около 1 мм.
В некоторых бактериях обнаруживают внехромосомные молекулы ДНК, представленные плазмидами, транспозонами и инсерционными (вставочными) последовательностями. Они не являются жизненно необходимыми, т. е. не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в энергетическом и пластическом метаболизме. Плазмиды физически либо не связаны с хромосомой (автономное состояние), либо встроены в бактериальную хромосому (интегрированное состояние). В автономном состоянии они самостоятельно реплицируются. Транспозоны и инсерционные последовательности (Is-посл.) во всех случаях связаны с хромосомой и не способны к самостоятельной репликации. Is-элементы несут информацию только для собственного перемещения, транспозоны, кроме того, имеют в составе структурные гены, кодирующие синтез токсинов, ферментов, расщепляющих углеводы, антибиотики.
Плазмиды - фрагменты ДНК с молекулярной массой 106 - 108 Д, несущие от 40 до 50 генов, несут 2 функции - регуляторную и кодирующую. Первая состоит в компенсации нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плазмиды в состав поврежденного бактериального генома, не способного к репликации, его функция восстанавливается за счет плазмидногорепликона. Кодирующая функция плазмид состоит во внесении в бактериальную клетку новой информации, о которой судят по приобретенному признаку, например образованию пилей (F-плазмиды), резистентности к а/б (R-плазмиды), выделению бактериоцинов (col-плазмида).
Конъюгативныеплазмиды - переносятся от бактерии к бактерии (обычно внутри вида или близкородственными видами) в процессе конъюгации, обычно это относительно крупные F-, R-, Col-плазмиды (чаще выявляются у Гр- палочек).
Неконъюгативныеплазмиды - обычно характерны для Гр+ кокков, но могут встречаться и у Гр - микроорганизмов; небольшие по размерам могут присутствовать до 30 на 1 клетку.Неконъюгативныеплазмиды тоже могут быть перенесены из клетки в клетку при наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативныхплазмид.
R-плазмиды обусловливают устойчивость к лекарственным препаратам, например к сульфаниламидам, стрептомицину, пенициллину, тетрациклину, либо устойчивость к тяжелым металлам (ртуть, никель, кадмий, кобальт).R-плазмиды выявляют постановкой чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар из бумажных дисков.
F-плазмиды - удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бактерий, т.е. увеличивает их «плодовитость». Интегрированные в бактериальную хромосому F-плазмиды называют Hfr-плазмиды (от англ. Highfrequencyofrecombitions - высокая частота рекомбинации). F-плазмида контролирует синтез половых ворсинок (sex илиFpili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации.
Col-плазмиды - контролируют синтез особого рода антибактериальных веществ белковой природы - бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов.Бактериоцины обнаружены у кишечной палочки (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины). Известно более 200 различных бактериоцинов.
Роль этих продуктов связана с формированием микробных сообществ (напрмер, в кишечнике человека бактериоциныE. coli вызывают гибель патогенных энтеробактерий). Бактериоциногения более выражена у Гр- микроорганизмов, но распространена и у Гр+ бактерий.
Способность к синтезу бактериоцинов используют в эпидемиологических исследованиях, выявляя тип колицина, вырабатываемого патогенным видом (колицинотипирование), либо тип плазмиды (колициногенотипирование).
Плазмиды биодеградации - данные плазмиды несут информацию об утилизации некоторых органических соединений, которые бактерии используют в качестве источников углевода и энергии. Они могут играть важную роль в экологии патогенных бактерий, обеспечивая им селективные преимущества во время пребывания в объектах окружающей среды и в организме человека. Например, урологические штаммы кишечных палочек содержат плазмидугидролизации мочевины.
Плазмиды патогенности - контролируют вирулентные свойства многих видов, особенно энтеробактерий. В частности F-,R-,Col-плазмиды в интегрированном состоянии включают tox+транспозоны, кодирующие токсинообразование. Нередко tox+транспозоны кодируют синтез интактныхпротоксинов (например, дифтерийного или ботулинического), активируемых клеточными протеазами, образование которых контролируют гены бактериальных хромосом.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 1071; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!