Гормон роста человека. Механизм биологической активности и перспективы применения в медицинской практике. Микробиологический синтез. Конструирование продуцентов
№4
Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии. Гибридомы. Значение гибридом для производства современных диагностических препаратов.
Клеточная инженерия – это метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции, базирующийся на использовании методов культуры клеток и тканей. Выделяют два направления развития клеточной инженерии:
использование клеток, переведенных в культуру, для синтеза различных соединений;
применение культивируемых клеток для получения из них растений-регенератов.
Растительные клетки в культуре – это важный источник ценнейших природных веществ, т.к. они сохраняют способность синтезировать свойственные им соединения: алкалоиды, эфирные масла, смолы, биологически активные вещества и т.п. Например, клетки женьшеня, переведенные в культуру, продолжают синтезировать, как и в составе целостного растения, ценное лекарственное сырье. Причем в культуре с клетками легче проводить любые манипуляции, используя индуцированный мутагенез, можно повышать продуктивность штаммов культивируемых клеток и проводить их гибридизацию гораздо проще, чем на уровне целостного организма. Кроме того, с ними, как и с прокариотическими клетками, можно проводить генно-инженерные работы.
Таким образом, клеточная инженерия позволяет конструировать клетки нового типа, комбинировать отдельные фрагменты клеток (ядра, митохондрии, пластиды, цитоплазму и хромосомы и т.п.), соединять клетки различных видов, относящиеся не только к разным родам, семействам, но и царствам.
|
|
|
Клеточная инженерия широко используется в селекции растений. Выделены гибриды томата и картофеля, яблони и вишни. Регенерированные из таких клеток растения с измененной наследственностью позволяют синтезировать новые формы, сорта, обладающие новыми свойствами и устойчивые к неблагоприятным условиям среды и болезням. Этот метод широко используется и для «спасения» ценных сортов, пораженных вирусными болезнями.
биотехнология Воронин с99-100.
Гибридомная технология.
Было предпринято множество попыток отыскать способы получения антител с узкой специфичностью. Так, при определенных условиях иммунизации бактериальными полисахаридами удается получить высокоиммуногенный препарат антител с узкой специфичностью, но большинство попыток оказались безуспешными. Высокоспецифические антитела были получены, когда антителообразующие клетки перенесли в организм летально облученных животных и из селезенки извлекали локальные зоны, содержащие очаги пролиферации одного клона иммунных лимфоцитов. Эти клоны продуцировали в сущности моноклональные антитела, но их можно было выделить в очень незначительных количествах. Данные опыты имели лишь теоретическое значение для оценки числа клонов и не давали препаративного способа получения моноклональных антител.
|
|
|
В 1975 г. Д. Келер и Ц. Милштейн предложили принципиально иной метод получения гомогенных антител. Они осуществляли слияние плазмацитомы с клетками селезенки иммунизированного животного, получив, таким образом, гибридомы, которые унаследовали от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки – синтезировать антитела предопределенной специфичности. Этот метод очень быстро получил широкое распространение во всем мире (Д. Келер и Ц. Милштейн в 1984 г. получили Нобелевскую премию).
Предпосылками для создания гибридомной технологии были ранее разработанные методы:
1) получение миелом и адаптация их культивирования вне организма;
2) соматическая гибридизация;
3) получение селективных культуральных сред.
Образование и отбор гибридных клеток
Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, состоит во введении мышам специфического антигена. После ряда иммунизации, проведенных в течение нескольких недель, проверяют, произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, извлекают селезенку, промывают ее, измельчают и несильно встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антителопродуцирующие β-клетки. Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанин- фосфорибозилтрансферазе (HGPRT-). Комбинированную взвесь в течение нескольких минут инкубируют в 35%-ном полиэтиленгликоле, а затем переносят в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ).
|
|
|
Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся слетки миеломы - селезенки, миеломы - миеломы, селезенки - селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы -селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки - селезенки вообще нe растут в культуре, а миеломные клетки НGPRT- и слившиеся клетки миеломы - миеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кис-лот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки
|
|
|
HGPRT- и слившиеся клетки миеломы - миеломы не могут синтезировать пурины в среде ГАТ и погибают.
Слившиеся клетки селезенки - миеломы растут в среде ГАТ, поскольку:
1) клетки селезенки поставляют функциональную HGPRT, которая может утилизировать экзогенный гипоксантин среды несмотря на блокирование синтеза пуринов с участием дигидрофолатредуктазы аминоптерином;
2) клетки миеломы способны активно делиться. Тимидин необходим для устранения блокирования в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибирова-нием дигидрофолатредуктазы. На 10 - 14-е сутки после слияния клеток в среде ГАТ остаются и растут только слившиеся клетки селезенки - миеломы. Их затем вносят в лунки пластиковых микротитровальных плашек и выращивают на полной культуральной среде без ГАТ.
Гормон роста человека. Механизм биологической активности и перспективы применения в медицинской практике. Микробиологический синтез. Конструирование продуцентов.
Гормон роста (соматотропный гормон, СТГ) – белок, секретируемый у позвоночных передней долей гипофиза. Наличие его в экстрактах из гипофиза было отмечено ещё в 1921г. Г.Эвансом и Дж. Лонгом, однако лишь в 1944г он был получен в виде очищенного препарата, а через несколько лет после этого (1948) – в кристаллическом состоянии. В зависимости от вида животного (бык, овца, свинья, крыса) молекулярная масса кристаллического препарата гормона роста колеблется от 20 до 22кДа. В гипофизе человека содержится от 4 до 10мг СТГ. В течение суток синтезируется 1-2мг гормона роста, период его полураспада составляет 21мин. Около 90% секретируемого в гипофизе гормона роста имеет молекулярную массу 2кДа, а остальное количество приходится на гормон с молекулярной массой 20кДа. В последнем отсутствует участок полипептидной цепи, содержащей 15 аминокислотных остатков в положении 32-46.Молекула гормона роста человека состоит из 191 аминокислотного остатка. Ген, ответственный за синтез СТГ человека, локализован на длинном плече 17-й хромосомы. Первичная структура гормона выяснена Ч.Ли и сотр. (1969) и уточнена Г.Найлом с сотр. (1973). Гормон роста обладает широким спектром биологической активности. Помимо ростостимулирующего действия СТГ обнаруживает гипергликемическое, липотропное или жиромобилизующее действие. За каждую данную функцию в молекуле соматотропина отвечает определенный участок аминокислотной последовательности. Гормон роста обладает ярко выраженным анаболическим действием и влияет на все клетки организма, повышая в них уровень биосинтетических процессов. Усиливает биосинтез белков, ДНК, РНК и гликогена, способствует мобилизации жиров из жировых депо и ускоряет распад высших жирных кислот. СТГ улучшает функцию почечных канальцев и нормализует минеральный и водный обмен организма. Исследования на молекулярном уровне показали, что СТГ стимулирует деятельность РНК-полимераз и полирибосомного аппарат клетки. Как свидетельствуют опыты с меченым фосфором, самым ранним эффектом действия гормона является синтез в ядрах клеток предшественников мРНК и рРНК. Вместе с тем велико его влияние и на проницаемость клеточных стенок, так как фонд внутриклеточных аминокислот в присутствии СТГ значительно возрастает, что способствует новообразованию белков. Возможно, первопричиной всех этих явлений служит всё же активирование мембранно-связанной аденилатциклазы. Вместе с тем показано, что СТГ повышает в крови особых стимулирующих рост факторов – соматомединов – белков с молекулярной массой примерно 7кДа. Механизм их действия активно изучается. Снижение секреции гормона роста наблюдается при гипергликемии и повышении уровня свободных жирных кислот в крови. СТГ высвобождается пульсирующим способом, выброс гормона происходит через каждое 3-5ч, а пик его секреции приходится на ночное время (через 1-4часа от начала сна).
Общего количества фармацевтического препарата, выпускаемого компаниями крупных производителей СТГ, хватало для лечения лишь одной трети случаев гипофизарной карликовости в развитых странах; недостаток соматотропина оказался ещё более острым с учетом других случаев его применения (незаживающие переломы, ожоги, язвы, нару1 шение гемопоэза).
К тому же возникли проблемы, связанные с гетерогенностью гормона, выделяемого из трупного материала. Несмотря на совершенствование выделения и очистки гормона, у 5% больных, получавших препарат, вырабатывались антитела, которые сводили на нет его биологическую активность. Кроме того, гипофизарный материал заражён нейро-токсическим вирусом с необычайно длительным инкубационным периодом, поэтому дети, получавшие СТГ, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении. Вирус, содержавшийся в препаратах СТГ, нередко приводил к летальному исходу. С 1985 г. ВОЗ запрещено применение гормона, выделяемого из человеческих гипофизов.
Рекомбинантный соматотропин, получивший название соматрем, стал вторым (после человеческого инсулина) биосинтетическим фармацевтическим препаратом. СТГ, биологически чистый и свободный от вирусных загрязнений, впервые был получен в 1980 г. фирмой «Genen-tech». Гормон, синтезированный в генетически сконструированных клетках кишечной палочки, отличается от гормона, выделенного из гипофиза, дополнительным остатком метионина на NН2-конце молекулы (гормон обладает биологической активностью нативного гормона и даже большим эффектом, чем гормон роста из гипофиза, по-видимому, по причине большей чистоты). У детей, страдающих гипофизарной карликовостью, зарегистрирован прирост 8-18 см в год, что несколько больше эффекта гормона, полученного из гипофиза. На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикцион-ными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединяли, затем «подстроили» к паре промоторов (промотор — специфическая последовательность в ДНК, необходимая для инициации транскрипции РНК-полимеразы) и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры Е. coli (100000 молекул гормона на клетку). СТГ, синтезированный в бактериях, обладал нужной м.м. и не связан с каким-либо бактериальным белком, от которого его необходимо было бы отщеплять.
Изменяя аминокислотную последовательность СТГ, т.е. его первичную структуру, посредством модификации кодирующего его гена, в бактериальных клетках можно синтезировать аналоги гормона, очень важные для изучения активных участков молекулы (например, участков, которые стимулируют рост или оказывают действие на неоглюко-генез) и этиологии карликовости на молекулярном уровне.
Используя методы рекомбинантных ДНК, можно синтезировать и другие факторы роста и факторы дифференцировки тканей, выделив вначале их мРНК, затем получив соответствующие гены. Это относится к соматомедину А, стимулирующему фиксацию серы в хряще, образование которого индуцируется соматотропином.
В 1982 г. выделен и синтезирован полипептид, содержащий из 44 аминокислотных остатков, обладающий полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение СТГ-РФ способно компенсировать недостаток соматотропина. Применение СТГ-РФ возможно не только для лечения гипо-физарной карликовости, но и при некоторых формах диабета и для ускорения регенерации тканей у людей, получивших сильные ожоги.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 1357; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!