Синтез различных классов интерферона человека в генетически сконструированных клетках микроорганизмов. Экспрессия генов, встроенных в плазмиду

Стр 1 из 2Следующая ⇒

Плесневые грибы - продуценты антибиотиков. Особенности строения клетки и цикла развития при ферментации. Антибиотики, образуемые плесневыми грибами.

Биотехнология (Быков 2009) с.28-40.

Пле́сневые грибы́, или пле́сень — различные грибы (в основном, зиго- и аскомицеты) образующие ветвящиеся мицелии без крупных, легко заметных невооруженным глазом, плодовых тел.

Семейства и виды плесневых грибов

Penicillium spp.
Aspergillus
Moniliaceae
Dematiaceae
Fusarium
Acremonium
Scytalidium dimidiatum (Nattrassia magniferae)
Onychocola canadensis

Распространение в природе

Плесневые грибы распространены повсеместно. В основном, обширные колонии вырастают в тёплых влажных местах, в питательных средах.

Штамм (от нем. Stammen, буквально — происходить) — чистая культура вирусов, бактерий, других микроорганизмов или культура клеток, изолированная в определённое время и в определенном месте. Поскольку многие микроорганизмы размножаются митозом (делением), без участия полового процесса, по существу, виды у таких микроорганизмов состоят из клональных линий, генетически и морфологически идентичных исходной клетке. Штамм не является таксономической категорией, наинизшим таксоном у всех организмов является вид, один и тот же штамм не может быть выделен второй раз из того же источника в другое время.^[1]

Отнесение микроорганизма к определённому виду происходит на основе достаточно широких признаков, таких как тип нуклеиновой кислоты и строение капсида у вирусов; способности расти на определённых углеводородах и тип выделяемых продуктов обмена веществ, а также консервативных последовательностях генома у бактерий. Внутри вида существуют вариации относительно, размера и формы бляшек (негативные «колонии» вируса) или колоний микроорганизма, уровню продукции ферментов, наличию плазмид, вирулентности и т. п.

В мире не существует общепризнанной номенклатуры названия штаммов, и используемые названия достаточно произвольны. Как правило, они состоят из отдельных букв и цифр, которые записываются после видового названия. Например, один из самых известных штаммов кишечной палочки — E. coli K-12.

Плесневые грибы достаточно широко используются человеком.

Штаммы гриба Aspergillus niger применяются для производства лимонной кислоты из сахаристых веществ^[1]
Штаммы Botrytis cinerea («Благородная гниль») участвует в созревании некоторых вин (херес).
Другие виды плесеней (т. н. «благородная плесень») используются для выделки специальных сортов сыра (рокфор, камамбер).
Часто плесень поражает плодовые тела съедобных грибов и делает их непригодными для сбора. Но иногда такие грибы становятся особыми объектами грибной охоты, см. о «грибах-лобстерах» в статье Hypomyces lactifluorum.

Вред от плесневых грибов

Опасность для человека

Микотоксины и антибиотики

Многие плесневые грибы вырабатывают вторичные метаболиты —антибиотики и микотоксины, угнетающе или токсично действующие на другие живые организмы. Наиболее известны следующие вещества

Микотоксины:

Афлатоксин
Т-2

Антибиотики:

Пенициллин
Цефалоспорины
Циклоспорин

Многие антибиотики вынужденно используются в концентрациях, близких к токсическим. Так, антибиотики гентамицин, стрептомицин, дигидрострептомицин, канамицин и другие могут оказать нефро- и ототоксическое действие.

Патогены

Некоторые плесневые грибы могут вызывать заболевания животных и человека — аспергиллёзы, онихомикозы и другие.

Плесневые грибы и сельское хозяйство

Некоторые плесневые грибы, существенно снижая урожай, могут оказывать неблагоприятное действие на здоровье сельскохозяйственных животных.

Грибы поражают запасы зерна, фураж, солому и сено. Иногда продукты становятся непригодными к использованию из-за токсичности метаболитов гриба.

При сильном развитии плесневых грибов в соломе возможно саморазогревание и даже воспламенение стогов.

Механизмы резистентности

У микроорганизма может отсутствовать структура на которую действует антибиотик (например бактерии рода микоплазма (лат. Mycoplasma) нечувствительны к пенициллину, так как не имеют клеточной стенки);
Микроорганизм непроницаем для антибиотика (большинство грам-отрицательных бактерий невосприимчивы к пенициллину G, поскольку клеточная стенка защищена дополнительной мембраной);
Микроорганизм в состоянии переводить антибиотик в неактивную форму (многие стафилококки (лат. Staphylococcus) содержат фермент β-лактамазу, который разрушает β-лактамовое кольцо большинства пенициллинов)
Вследствие генных мутаций, обмен веществ микроорганизма может быть изменён таким образом, что блокируемые антибиотиком реакции больше не являются критичными для жизнедеятельности организма;
Микроорганизм в состоянии выкачивать антибиотик из клетки^{[источник не указан 85 дней]}.

Применение

Антибио́тики (от др.-греч. ἀντί — anti — против, βίος — bios — жизнь) — вещества природного или полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых клеток, чаще всего прокариотических или простейших.

По ГОСТ 21507-81 (СТ СЭВ 1740-79)

Антибиотик — вещество микробного, животного или растительного происхождения, способное подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель.

Антибиотики природного происхождения чаще всего продуцируются актиномицетами, реже — немицелиальными бактериями.

Некоторые антибиотики оказывают сильное подавляющее действие на рост и размножение бактерий и при этом относительно мало повреждают или вовсе не повреждают клетки макроорганизма, и поэтому применяются в качестве лекарственных средств.

Некоторые антибиотики используются в качестве цитостатических (противоопухолевых) препаратов при лечении онкологических заболеваний.

Антибиотики не воздействуют на вирусы, и поэтому бесполезны при лечении заболеваний, вызываемых вирусами (например, грипп, гепатиты А, В, С, ветряная оспа, герпес, краснуха, корь).

Терминология

Полностью синтетические препараты, не имеющие природных аналогов и оказывающие сходное с антибиотиками подавляющее влияние на рост бактерий, традиционно было принято называть не антибиотиками, а антибактериальными химиопрепаратами. В частности, когда из антибактериальных химиопрепаратов известны были только сульфаниламиды, принято было говорить обо всём классе антибактериальных препаратов как об «антибиотиках и сульфаниламидах». Однако в последние десятилетия в связи с изобретением многих весьма сильных антибактериальных химиопрепаратов, в частности фторхинолонов, приближающихся или превышающих по активности «традиционные» антибиотики, понятие «антибиотик» стало размываться и расширяться и теперь часто употребляется не только по отношению к природным и полусинтетическим соединениям, но и к многим сильным антибактериальным химиопрепаратам.

Синтез различных классов интерферона человека в генетически сконструированных клетках микроорганизмов. Экспрессия генов, встроенных в плазмиду.

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих главным образом в формировании и регуляции защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в регуляции ряда нормальных физиологических функций. Цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции, существующую наряду с нервной и эндокринной системами поддержания гомеостаза, причем, все три системы тесно взаимосвязаны и взаимозависимы.

История изучения цитокинов началась в 40-е годы ХХ века. Именно тогда были описаны первые эффекты кахектина – фактора, присутствовавшего в сыворотке крови и способного вызывать кахексию или снижение веса тела. В дальнейшем данный медиатор удалось выделить и показать его идентичность фактору некроза опухолей (ФНО). За последние два десятилетия клонированы гены большинства цитокинов и получены рекомбинантные аналоги, полностью повторяющие биологические свойства природных молекул. Сейчас известно уже более 200 индивидуальных веществ, относящихся к семейству цитокинов.

К цитокинам относят интерфероны, колониестимулирующие факторы (КСФ), хемокины, трансформирующие ростовые факторы; фактор некроза опухолей; интерлейкины со сложившимися исторически порядковыми номерами и некоторые другие эндогенные медиаторы. Интерлейкины, имеющие порядковые номера, начиная с 1, не относятся к одной подгруппе цитокинов, связанных общностью функций. Они в свою очередь могут быть разделены на провоспалительные цитокины, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов, отдельные регуляторные цитокины.

Классификация цитокинов может проводиться по их биохимическим и биологическим свойствам, а также по типам рецепторов, посредством которых цитокины осуществляют свои биологические функции. Ниже приведена объединенная структурно-функциональная классификация, где все цитокины разделены на группы, в первую очередь с учетом их биологической активности, а также указанных выше особенностей строения молекул цитокинов и их рецепторов [Симбирцев А.С., 2004].

Классификация цитокинов

1. Интерфероны I типа (ИФН a,b,d,k,w,t, ИЛ-28, ИЛ-29 (ИФН l));

2. Колониестимулирующие факторы, гемопоэтины:

– Фактор стволовых клеток;

– Лиганды gp140 (ИЛ-3, ИЛ-5, ГМ-КСФ);

– Эритропоэтин, тромбопоэтин.

3. Семейство фактора некроза опухолей (ФНО, лимфотоксины α и β);

4. Суперсемейство интерлейкина-1 и фактора роста фибробластов (ФРФ):

– Семейство ФРФ

– Семейство ИЛ-1 (ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-33 и др.).

5. Семейство интерлейкина-6 (ИЛ-6, ИЛ-11, ИЛ-31).

6. Семейство интерлейкина-10 (ИЛ-10,19,20,22,24,26)

7. Cемейство интерлейкина-12 (ИЛ-12,23,27)

8. Цитокины Т-хелперных клонов и регулирующие функции лимфоцитов (ИЛ-2, ИЛ-4-5, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-21, ИФНg)

9. Семейство интерлейкина 17 (ИЛ-17A, B, C, D, E, F)

10. Хемокины.

11.Факторы роста:

– Суперсемейство фактора роста нервов, тромбоцитарного ростового фактора и трансформирующих ростовых факторов

– Семейство эпидермального ростового фактора (ЭРФ, ТРФα и др.);

– Семейство инсулиноподобных ростовых факторов (ИРФ-I, ИРФ-II).

Цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции основных функций организма, существующую наряду с нервной и эндокринной регуляцией и связанную в первую очередь с поддержанием иммуного гомеостаза при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей. В рамках иммунной системы цитокины осуществляют двустороннюю взаимосвязь между факторами неспецифической защиты и специфическим иммунитетом.

В клинической практике существует три основных направления использования цитокинов:

1. цитокиновая терапия для активации защитных реакций организма, иммуномодуляции, либо восполнения недостатка эндогенных цитокинов;

2. антицитокиновая иммуносупрессивная терапия, направленная на блокирование биологического действия цитокинов и их рецепторов;

3. цитокиновая генотерапия в целях усиления противоопухолевого иммунитета или коррекции генетических дефектов в системе цитокинов.

Цитокины используются в клинической практике как для системного, так и для местного применения. Системное введение оправдывает себя в тех случаях, когда нужно обеспечить действие цитокинов в нескольких органах для боле эффективной активации иммунитета либо активировать клетки-мишени, расположенные в разных частях организма. Наибольшее клиническое применении в настоящее время нашли цитокины из группы интерферонов (ИФН), прежде всего альфа-ИФН и бета-ИФН, в меньшей степение гамма-ИФН.

Интерфероны – группа белков с противовирусным действием, вырабатываемая эукариотическими клетками в ответ на внедрение в них ряда биологических агентов – интерфероногенов (РНК-геномные вирусы, двунитчатые РНК, различные полианионы, бактериальные ЛПС).

ИФН обусловливают разнообразные эффекты, проявляющиеся как на клеточном, так и на системном уровне. Для ИФН характерно наличие трех основных эффектов – неспецифического противовирусного, противоопухолевого и иммуномодулирующего. Интерфероны обладают осуществляют ингибицию репродукции многих вирусов. Противовирусное действие интерферона основывается на подавлении соединения вирусной РНК с рибосомами клетки, что приводит к невозможности осуществления репродукции вируса в клетке.

В 70-х годах все ИФН подразделяли на 2 типа: индуцированные вирусами (лейкоцитарный и фибробластный), которые относили к первому типу и индуцированные мутагенами (иммунный) - ко второму. В настоящее время эта классификация утратила свое значение. В 1980 г. комитетом экспертов Всемирной организации здравоохранения была принята и рекомендована к использованию классификация, согласно которой все ИФН человека подразделяют на 3 класса. Они кодируются различными генами и имеют характерную для каждого класса последовательность аминокислот, из которых построены их молекулы. При наличии рекомбинантных вариантов ИФН их обычно обозначают римскими буквами.

Таблица 11- Классификация интерферонов человека

Класс ИФН	Используемое наименование	Тип ИФН	Наличие подтипов. Наименование рекомбинатных вариантов
Лейкоцитарный	Альфа-ИФН	I	Более 24
Фибробластный	Бета-ИФН	I	Существуют
Иммунный	Гамма-ИФН	II	Существуют

В настоящее время все полученные знания о ИФН можно обобщить в науку «интерфенология», которая включает теоретические и практические (медицинские и фармацевтические) аспекты этой проблемы. В последнее десятилетие произошло 4 важнейших события в интерфенологии (выделены проф. Ф. И. Ершовым, 1996):

- сформулировано понятие «система интерферона» и выявлены ее прямые и обратные связи с системами иммунитета и нейроэндокринной системой;

- открыта множественность генов ИФН-ct (более 20 в клетках человека);

- с помощью современных технологических приемов усовершенствованы существующие и созданы препараты ИФН нового поколения, прошли апробацию оригинальные индукторы ИФН;

- определены показания и противопоказания для клинического использования ИФН и их индукторов при вирусных и невирусных заболеваниях.

В качестве индуктора интерфероногенеза используют вакцинный штамм вируса болезни Ньюкасла или вирус Сендай. Предварительное культивирование вирусов проводят в развивающихся 9-11 сут. куриных эмбрионах. Основные технологические операции: овоскопия, отбраковка, инкубирование куриных эмбрионов, введение инфекционной взвеси в аллантоисную полость с последующим инкубированием в течение 48-72 часов и стягиванием инфицированной жидкости у погибших куриных эмбрионов. Вирусосодержащую аллантоисную жидкость центрифугируют

Очень важной операцией, определяющей качество готового препарата, является удаление из лейкоконцентрата примесей эритроцитов (стадия 1). Наиболее полно устраняет присутствие эритроцитов в лейкоконцентрате их избирательный лизис раствором хлористого аммония в физиологической концентрации.

Таблица 12- Технологическая схема биосинтеза ИФН-а

Технологическая стадия	Условия
1. Выделение лейкоцитов	Фракционирование лейкомассы с декстра-
	ном и поливиниловым спиртом с после-
	дующим гемолизом. При этом образуется 3
	слоя. 2 верхних слоя подвергают центрифу-
	гированию и ресуспендированию осадка в
	питательной среде.
2. Прайминг (активирование	Лейкоциты 10-20 млн/мл в среде № 199 с
метаболизма лейкоцитов)-	5% плазмы донорской крови, 3 ед/мл,
2-10 ч, 37,5°С	0,0015 ед/мл инсулина, 200 МЕ/мл нативного
	ИФН
3. Введение вируса индуктора
3.1.Индукция 1 ч, 37,5°С	Вирус болезни Ньюкасла (ВБН), в дозе 5
	РЦЦ₅₀ на 1 лейкоцит
3.2.Отделение неабсорбиро-	Центрифугирование 600х д - 15 мин.,
вавшегося вируса	сбор осадка индуцированных клеток.
4. Биосинтез 18 ч, 37,5°С	Суспензионная культура Лейкоциты 6 млн/мл в среде № 199 с 5% гаммаглобулиновой плазмой, 5мл натрия сукцината, бикарбонат натрия до рН 7,5, антибиотики. Выход ИФН-а 3-4 ME на 1 тыс. лейкоцитов.
5.Инактивация вируса интерферона	Доведение рН среды до 2,2-2,4 и экспозицией полуфабриката не менее 7 суток.
6. Очистка интерферона	Поэтапно: осветляющая, ультрафильтрация, стерилизующая фильтрация

На этапе культивирования лейкоцитов (стадия 2) лейкоконцентрат ресуспендируют в культуральной жидкости, которая, помимо основных компонентов, содержит некоторые белки сыворотки крови, без которых биосинтез ИФН практически не происходит. Также установлено, что при культивировании лейкоцитов, особенно при большой плотности суспензии (10⁷клеток/мл), в них активируются метаболитические процессы, что сопровождается образованием кислых продуктов. В связи с этим важно в период прайминга и биосинтеза ИФН сохранять рН среды в оптимальных пределах. Для поддержания рН среды на необходимом уровне к среде добавляют различные вещества, обладающие буферной емкостью.

Оптимальные условия при выработке ИФН (стадия 4) создаются при культивировании лейкоцитов при 37-37,5°С. Снижение температуры инкубирования до 35°С и ниже, или, напротив, повышение ее до 38°С и выше приводило значительному ослаблению продукции ИФН.

ИФН-а может продуцироваться как в стационарных условиях культивирования, так и в культурах с постоянным перемешиванием клеток. Считается, что клетки во взвешенном состоянии более интенсивно вырабатывают ИФН-а. Большое значение для выживания клеток в суспензионных культурах имеет форма сосудов, высота слоя жидкости и достаточные количества кислорода в воздушной среде. Оптимальные условия для получения титров ИФН-а создаются при культивировании лейкоцитов в круглодонных колбах, накрытых фольгой, заполненных клеточной взвесью наполовину, при постоянном перемешивании. Предварительная обработка лейкоцитов малыми дозами ИФН-а приводила к увеличению выхода ИФН в 3-10 раз.

После ресуспендирования лейкоциты индуцируют аллантоисными (без оболочки) вирусами болезни Ньюкасл или Сендай. После инкубации в течение 20 часов при температуре 37,5°С, во время которой преимущественное значение имеет поддержание жизнеспособности культур и высокого метаболизма клетки при постоянстве рН, клетки отделяют низкоскоростным центрифугированием (2 000 об/мин.) в течение 40 минут. Активность интерферона в препаратах, полученных в результате описанной процедуры, составляют 30-200 000 ЕД/мл.

В современной биотехнологии все более широко используются методы генной инженерии. Уже во многих лабораториях мира успешно получают и интегрируют в генетический аппарат культивируемых бактериальных или соматических клеток гены, кодирующие образование ряда биологически активных веществ.

Функциональные гены для биотехнологического производства воссоздают методом обратной транскрипции или синтезируют из отдельных нуклеотидов, выделяя из ДНК соответствующих хромосом.

Опыты по переносу генов ИФН человека в бактериальные клетки были начаты в конце 70-х годов. Почти одновременно в 3 научно-исследовательских группах: в Институте молекулярной биологии I Цюрихского университета под руководством Вейсмана, в отделе биохимии Института по исследованию рака в Токио под руководством Т.Танигучи и в США филиалом фирмы «Genentech» под руководством Дж. Геддела.

Все три группы исследователей использовали для клонирования метод обратной транскрипции мРНК интерферонов. В качестве примера рассмотрим ход экспериментов группы Вейсмана.

Для клонирования гена а-ИФН в качестве исходного материала использовали фракцию 12 S поли (А) мРНК (информационная аденилированная РНК), полученную из клеток лейкоцитов, индуцированных вирусом Сендай. На базе информационной РНК получена комплементарная ей ДНК, состоящая из 2 цепей. Полученная двухспиральная ДНК была расщеплена с помощью рестриктаз путем образования липкого конца олиго-dG. Аналогичная операция была проведена с плазмидой с образованием липкого олиго-dС-конца. С помощью лигаз осуществлено встраивание комплементарного ДНК, содержащей информацию о структуре а-ИФН в плазму pBR322.

Эта плазмида несет в своем составе гены, определяющие устойчивость к двум антибиотикам: тетрациклину и ампицилину. Вставка ДНК интерферона инактивирует ген, ответственный за устойчивость к ампицилину, поэтому первичный отбор клеток, получивших гибридные плазмиды, шел по устойчивости к тетрациклину.

Для отбора нужных клонов использовали следующий метод: смесь нескольких плазмид из разных клонов, одна из которых может содержать ДНК интерферона, денатурируют и связывают с твердой подложкой. С этой ДНК гибридизируют образцы РНК, полученные из продуцирующих ИФН клеток человека, фильтры промывают, элюируют РНК в денатурирующих условиях и элюат инъекцируют в овоциты африканской зеленой лягушки для выявления мРНК интерферона. Среди гибридизирующихся клонов выбран один, названный Hif-2h, имеющий вставку соответствующую размеру полного гена a- ИФН.

Клетки кишечной палочки, содержащие гибридные плазмиды, несущие такую вставку способны синтезировать полипептид с биологической активностью интерферона.

Работы по клонированию генов интерферона были повторены и развиты как названными выше авторами, так и другими группами исследователей во многих странах. В СССР первое успешное клонирование гена лейкоцитарного интерферона описано в 1982г. акад. Овчинниковым, фибробластного в 1983 г. -Ю.И. Козловым, иммунного - в 1985 г. Е.Д. Свердловым.

В настоящее время экспрессия генов ИФН произведена не только в клетки кишечной палочки, но и в клетки других грамотрицательных бактерий (Pseudomonas) - лежит в основе промышленного производства ИФН в России. В настоящее время считается, что наиболее эффективно использование для этих целей дрожжей.

Дрожжи рода Saccharomyces не патогенны для человека, имеют многовековой опыт их использования. Дрожжи не подвержены лизису, автолизу, легко сепарируются, используют дешевые субстраты. Биомасса дрожжей не содержит токсичных и пирогенных факторов, как клетки грамотрицательных бактерий.

Весьма важным обстоятельством является также сходство секреторных механизмов дрожжей и высших эукариот, это позволяет предположить, что клонированные гены преинтерферонов смогут давать зрелый ИФН в результате правильного процессинга.

Отработана технология массового культивирования клеток-продуцентов рекомбинантного ИФН. Так, для отечественного препарата реаферона она включает:

· культивирование бактериального штамма-продуцента реаферона в ферментерах объемом 100 л с выходом 5-7x103 ME из 1 л культуральной жидкости,

· разрушение биомассы методом, позволяющим увеличить процесс с 60-70 %-ным выходом целевого продукта,

· предварительную очистку реаферона на ионнообменнике; окончательную очистку препарата проводят на иммуносорбенте с моноклональными антителами к лейкоцитарному ИФН-а типа 5АС.

Основным продуцентом рекомбинантного ИФН являются бактериальные штаммы, в цитоплазме, которых синтезируется ИФН и составляет лишь доли процента от общей массы бактериальных белков. После накопления в специальных ферментерах достаточно высокой концентрации клеток их удаляют из ферментера и разрушают (лизируют). В качестве основных методов лизиса используют: осмотический шок, замораживание-оттаивание, гомогенизирование, обработку детергентами. Затем с помощью последовательных процедур фильтрования, центрифугирования, ионообменной хроматографии и гель-хроматографии происходит предварительная очистка ИФН, дающая в итоге прозрачный бактериальный экстракт, в котором ИФН все еще составляет не более 1-2% от общего количества белка. Окончательную очистку препарата на иммуносорбенте с моноклональными антителами к ИФН.

Моноклональные антитела к ИФН «пришивают» к гранулам носителя и помещают в хроматографическую колонку. Затем наносят на колонку бактериальный экстракт, содержащий рекомбинантный ИФН. С антителами связывается лишь ИФН, другие же компоненты экстракта, в том числе все бактериальные токсины, свободно проходят через колонку и удаляются промывным раствором. Для извлечения из колонки адсорбировавшийся на антителах рекомбинантный ИФН через нее пропускают элюирующий буферный раствор, имеющий слабокислую реакцию. При этом связь между молекулами ИФН и антителами нарушается. ИФН переходит с поверхности частиц сефарозы в буферный раствор и может быть собран в виде чистого вещества, не содержащего загрязняющих белков.

Стремительное расширение использования рекомбинантных ИФН и параллельное сокращение в последнее время применения природных препаратов связано, главным образом, с дефицитом сырья для производства последних (донорская кровь), а также с распросранением вирусных заболеваний, передающихся через кровь (ВИЧ, гепатит С). В связи с чем, несмотря на наличие некоторых преимуществ препаратов природных ИФН, в клинике используются практически только рекомбинантные препараты.

Семейство ИФН-а содержит около 20 подтипов, поэтому природные препараты - Человеческий лейкоцитарный интерферон, Эгиферон, Вэлферон многокомпонентны и содержат все или, по крайней мере, большинство из подтипов. Природные ИФН не обладают антигенными свойствами и не вызывают сенсибилизации при длительном многократном введении. Некоторые рекомбинантные ИФН, напротив, при введении инъекционным путем могут вызвать образование нейтрализующих или связывающих антител.

Наиболее часто используются постые (непегилированные) и пегилированные альфа- и бета-ИФН. Например рекомбинантные ИФН-a2а (Реаферон, Роферон, Пегасис), рекомбинантные ИФН-a2b (Интрон А, Реальдирон, Пег-Интрон), являющиеся аналогами природных подтипов с точечными мутациями в белковой структуре lis-his, arg-his, arg-arg, соответственно, которые мало влияют на активность, но существенны с точки зрения сенсибилизации. Так препараты ИФН-a2а, не являющиеся характерными для человеческой популяции, имеют большой риск вызвать сенсибилизацию и образование антител, которые в высоких титрах будут снижать их терапевтический потенциал.

Иммунный интерферон (гамма-ИФН) может рассматриваться в качестве компонента лекарственных средств, предназначенных для лечения вирусных, онкологических и аутоиммунных заболеваний. За рубежом создан ряд препаратов на его основе: Иммунерон (США), Иммуномакс (Япония), Имукин (Германия). В России разработана эффективная схема получения высокоочищенного Дельтаферона, основанная на двух последовательных хроматографиях на одном сорбенте, но при разных значениях рН. Данная схема позволяет получать рекомбинантный Дельтаферон в препаративных количествах с допустимым содержанием высокополимерных примесей. Изменения в белковой молекуле (укорочение молекулы на 10 аминокислот и 3 аминокислотные замены) привели к 20-кратной потере антивирусной активности по сравнению с полноразмерным ИФН-γ, но не сказались на его иммуномодулирующих свойствах. В результате данной модификации у дельтаферона появилась устойчивость к протеолитическим ферментам. Разработаны экспериментальные лекарственные формы дельтаферона, которые позволяют сохранять белок в нативном состоянии без потери специфической активности. ЛФ дельтаферона обладают присущими исходному гамма-интерферону иммуномодулирующими свойствами.

С фармакологической точки зрения препараты ИФН должны рассматриваться, прежде всего, как иммуномодуляторы, оказывающие воздействие на функциональную активность эффекторных клеток иммунной системы и прежде всего Т-лимфоцитов и моноцитов (макрофагов). Под действием ИФН повышается эффективность иммунного распознавания антигена и усиливаются фагоцитарная и цитолитическая функции, направленные на элиминацию возбудителя или антигенно-измененных клеток. Интерферон циркулирует в организме около 2-х недель, что следует учитывать при применении его как профилактического средства.

Многолетний опыт показал, что при интраназальном введении ИФН обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении различных вирусов гриппа и парагриппа. Защитное действие наиболее выражено при ежедневном применении препарата с помощью ингаляторов или распылителей. Многократные интраназальные инсталляции или ингаляционное введение раствора препарата через нос и рот в форме аэрозоля в течение первых двух дней болезни приводило к более быстрому снижению явлений интоксикации и лихорадочной реакции. Быстрее уменьшались и выраженность воспалительных явлений в верхних дыхательных путях. Исследования последних лет показали, что ИФН подавляет размножение опухолевых клеток, что делает его эффективным при лечении опухолевых заболеваний. Противоопухолевое действие ИФН можно объяснить стимуляцией естественных защитных механизмов организма, в частности на лимфоциты, которые убивают раковые клетки или образуют антитела.

К настоящему времени определен круг заболеваний, при которых эффективно использование ИФН. Из вирусных инфекций - это ОРВИ, грипп, энцефалиты, вирусные гепатиты, герпетические поражения глаз (конъюнктивиты, кератоконъюктивиты), слизистых оболочек и глаз. По мнению клиницистов при герпетических поражениях кожи и слизистых оболочек следует отдавать предпочтение местному применению препарата. ИФН нашел применение при пересадках органов как средство, предупреждающее вторичные вирусные инфекции. Краткий анализ позволяет заключить, что ИФН способен положительно влиять на развитие самых различных заболеваний вирусной этиологии. Его эффективность наиболее выражена при острых инфекциях, на ранних сроках заболевания. При клиническом использовании следует отдавать предпочтение местному введению, обеспечивающему минимальный расход препарата. Кроме того, местное применение позволяет избежать отрицательных явлений, наблюдающихся при системном введении высоких доз ИФН.

Каждая лекарственная форма имеет свою область применения, обусловленную ее иммунобиологическими и фармакологическими свойствами. Это положение формулируется следующим образом:

Препараты ИФН не должны вызывать явлений сенсибилизации при длительном многократном применении прерывистыми курсами. Биосинтез ИФН для приготовления различных лекарственных форм может проводиться по единой технологической схеме, но способы очистки ИФН и ее критерии должны отвечать задачам терапии. В инъекционных лекарственных формах примеси, антигенные для человека, должны отсутствовать. Их уровень в препаратах для местного пользования должен быть ниже порога сенсибилизации.

Теоретически в природных препаратах ИФН-a могут присутствовать 3 основные группы антигенов:

· антигены вируса-индуктора и куриной аллантоисной жидкости;

· эритроцитарные антигены, определяющие группу крови и резус-принадлежность;

· лейкоцитарные антигены HLA.

Биотехнология получения ИФН должна включать операции, ограничивающие возможность проникновения этих антигенов в лекарственные формы. Технологически наиболее трудной задачей является удаление анитигенов I группы, так как на стадии индукции их вводят в суспензию в большом количестве.

Препараты природного ИФН-a в зависимости от методов очистки можно разделить на две группы - нативные и концентрированные. Препараты нативного типа по белковому составу практически не отличается от исходных полуфабрикатов, характеризуются невысокой удельной активностью - до 1-104 ME на 1 мг белка, но сохраняют все цитокины, продуцированные в процессе интерфероногенеза, в их естественном соотношении. Поэтому они обладают высоким потенциалом иммунобиологического действия.

Биотехнология получения концентрированных препаратов включает химическую очистку, что приводит к снижению потенциала иммунобиологического действия из-за утраты цитокинов. Однако эти препараты представляют также ценность для практического здравоохранения. Например, высококонцентрированный человеческий лейкоцитарный ИФН – ЧЛИ для инъекций –пока незаменим в ситуациях, когда необходимо ввести высокие разовые дозы (лимфобластный лейкоз в стадии обострения), а также при лечении вирусных и онкологических поражений, локализованных за гематоэнцефалическим барьером. К препаратам концентрированного типа относится и интерлок, который успешно применяют для местного лечения вирусных поражений глаз.

Третью группу составляют рекомбинантные ИФН, представленные реафероном и реальдоном. При многих формах патологии препараты для местного применения (интраназальные капли, мазь, ректальные суппозитории, глазные пленки и др.) более эффективны, чем инъекционные. Например, при активном хроническом ВГВ использование ректальных суппозиториев, содержащих всего 100 000 ME ИФН-а, дает такие же результаты, как и внутримышечное введение высококонцентрированного препарата в дозе 3 ME. Расход препарата и стоимость лечения при применении ректальных суппозиториев снижается в десятки раз.

Современные рекомбинантные препараты ИФН:

Реаферон (человеческий рекомбинантный ИФН-а2) производство НПО «Вектор» г. Новосибирск.

· получен при культивировании бактериального штамма Pseudomonas sporogenosa, содержащего в своем генетическом аппарате встроенную рекомбинантную плазмиду гена ИФН-а2 человека.

· предназначен для внутримышечного, субконъюнктиванного и местного применения.

Выпускается в виде лиофилизированного порошка в ампулах.

Интрон А (человеческий рекомбинантный ИФН-a2b) фирмы Schering Plough -США.

Препарат получен по рекомбинантной ДНК-технологии с использованием бактериальных E.coli, содержащих встроенный генно-инженерным путем ген, кодирующий этот человеческий белок.

Спецификация активности 2*108 МЕ/мг белка.

Интрон А рекомендуется для лечения волосатоклеточного лейкоза, множественной рецидивирующей миеломы у пациентов, нечувствительных ко всем видам химиотерапии, а также саркомы Капоши, ассоциированной со СПИДом.

Введение больших доз белка сопровождается повышением температуры, появлением головной боли, расстройством желудочно-кишечного тракта (тошнота, иногда обострение гепатита), возникают нарушения в работе сердечно-сосудистой системы.

На основании изучения онтогенеза системы ИФН разработан новый отечественный препарат виферон-суппозитории, включающие в себя рекомби-нантный ИФН-а, и препараты антиоксидантного действия. Виферон положительно зарекомендовал себя при лечении вирусных и бактериальных заболеваний у новорожденных детей: внутриутробный герпес, хламидиоз, ОРВИ, кандидоз

Пегилированные интерфероны

Противовирусная терапия - одна из основных областей перспективного использования пегилированных препаратов пептидной структуры. Ярким примером использования концепции пегилирования биотехнологических препаратов является создание пегилированных интерферонов (пег-ИФН). К клинической практике, в настоящее время, применяются пегилированные аналоги альфа-интерферона - ПЭГ-интерферона-альфа 2b (Пегинтрон; Shering Plough) и ПЭГ-интерферона-альфа 2а (Пегасис; Hoffmann La Roche).

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 1265; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

12 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!