Применение растительных клеток для трансформации лекарственных веществ. Иммобилизация растительных клеток. Методы иммобилизации
Известно около 20000 веществ, которые получаются только из растений и в
этом плане мир растений эксплуатируется человеком настолько давно и упорно,
что воспроизводство этих растений создает проблемы, т.е. оно не успевает за
темпами своего уничтожения в нарушение гармонии нашей связи.
Поэтому все большее внимание в мире привлекает технология выращивания
культур клеток растений in vitro с целью получения природных веществ
различного применения и спектра действия.
Первый вопрос. Так что же конкретно лежит в основе перспективного развития
биотехнолгического направления в получении веществ растительного
происхождения, помимо решения экологических проблем. Ответ.
1. -это независимость от влияния климатических, сезонных и географических
условий,
2. -это уменьшение (освобождение для других нужд) площадей почвы в
хозяйственном обороте страны (мы уходим от истощения почвы также или
дополнительных экономических затрат),
3. -это получение уже известных веществ, присущих интактному растению
(например, никотин, кодеин, хинин_______, диосгенин и т.д.)
4. -это синтез новых продуктов, веществ,
5. -это использование культуры клеток для биотрансформации конечного
продукта.
В нашей стране разработаны и внедрены в промышленное производство
технологии получения БАВ из биомассы женьшеня и родиолы розовой. В
Японии особенно широко выведен на поток процесс производства пигмента и
|
|
|
антибиотического агента – шиконина с использованием культуры воробейника.
Промышленный способ выращивания изолированных культур дает
возможность за короткий срок 30-45 суток получать значительный объем
ценного лекарственного сырья.
Метод биотехнологии получения ЛС на основе культур клеток растений,
начинается с процесса получения культуры каллусной ткани или каллуса.
Краткая историческая справка. Впервые каллусная культура была получена в
1902 году (начало прошлого века) Хаберландом. Культура каллусной ткани
состоит из сообщества клеток, выращиваемых на искусственной
питательной среде. Что касается использования таких культур, то надо
отметить, что до середины 50-х годов прошлого века использовали их как
модельную систему для исследования физиологических и биохимических
процессов, работая с изолированными клетками и органами растений. А в 60-х
годах было доказано, что культуры клеток растений могут быть продуцентами и
синтезировать на искусственных питательных средах различные вещества,
присущие интактному растению. В этой связи мы можем обратиться к такому
понятию как тотипотентность.
|
|
|
Приведем определение тотипотентности. Тотипотентность – это способность
любой клетки образовывать полноценное растение, что предопределено его
генетическим и физиологическим потенциалом (или естественными
возможностями), необходимым для образования вторичных метаболитов.
Третий вопрос. Нас интересует насколько такой процесс по выделению
вторичных метаболитов является стабильным. Стабильность по выходу
продукта вторичных метаболитов связывают с двумя параметрами:
1. с дифференцировкой клеток,
2. со стадией культивирования
Например, дифференцированные корневые каллусы Atropa belladonna
синтезируют тропановые алалоиды, а недифференцированные уже не способны
к их синтезу Но с другой стороны Rauwolfia serpentinа способна синтезировать
индолиловые алкалоиды недифференцированными клетками с достаточно
большим выходом метаболитов. Отсюда можно сделать вывод, что
морфологическая специализация клеток не является основной предпосылкой
БАВ, т.е. здесь нет прямой связи.
Каллус (от латинского callus- толстая кожа,
мозоль), представляет ткань, которая образуется в местах повреждения
органов растения и обычно возникающая при неорганизованной
пролиферации клеток растения. Используется для получения
|
|
|
изолированных тканей и клеток растения.
Можно вспомнить, что клетка in vitro – это морфофизиологическая,
дифференцированная структурная живая система, основными составляющими
которой являются клеточные стенки, ядро, протопласт, система вакуолей.
Клетки отличаются по форме и размеру.
В процессе цитокинеза формируется клеточная оболочка, разделяющая
материнскую клетку на 2 новые, идентичные одна другой клетки.
Что касается источников получения каллусов - изолированные культуры
каллусов получают из различных органов растений (корни, побеги, листья) или
из определенного типа клеток (эндосперма, пыльца).
Технология получения каллуса- Выбранный эксплантант, представляющий
вырезанные маленькие кусочки (2-4 мм ) растительной ткани, которые находятся
в подходящем биологическом состоянии (они молоды, здоровы ), что
необходимо для получения каллусных культур. Этот растительный материал
тщательно моют, стерилизуют гипохлоридом натрия, 96% спиртом или 0,1%
сулемы, затем тщательно промывают дистиллированной водой и помещают на
синтетическую агаризованную питательную среду. Сосуды закрывают ватно-
марлевыми тампонами. Конечно, при этом необходимо соблюдать строгие
|
|
|
правила антисептики (работают только в боксах). Для образования каллуса и
роста ткани сосуды переносят в темное помещение, где строго поддерживают
определенный режим. Это касается температуры и влажности. Известно, что для
большинства культур эти параметры таковы: температура +24-26 0, а влажность
65-70%. Через 2-3 недели на раневой поверхности образуется первичный каллус.
Весьма существенным в вопросе обеспечения роста и синтеза продуктов
вторичного метаболизма является подбор ингредиентов среды культивирования,
что определяется конечной целью биотехнолога.
Это:
1. формирование биомассы
2. синтез вторичных продуктов.
Остановимся на стадиях получения биомассы, обозначим эти стадии как
технологию получения биомассы:
1. Приготовление оборудования
2. Приготовление питательной среды
3. Стерилизация питательной среды
4. Посев ткани на питательную среду
5. Выращивание биомассы
6. Съем сырой биомассы и высушивание.
Что касается особенностей 2-ой стадии, то компоненты среды можно
разделить на 6 групп, что будет отражать и ее приготовление:
1. макроэлементы
2. микроэлементы
3. источники железа
4. органические добавки – витамины
5. источники углерода
6. органические добавки – регуляторы роста растений –ауксины и
цитокинины (играют роль пусковых механизмов).
Культивирование ведется на жидких и твердых питательных средах.
Теперь рассмотрим факторы, от которых зависит накопление вторичных
метаболитов в процессе культивирования растительных клеток.
Первый фактор.
1. Регуляторы роста растений как мы уже говорили, являются пусковыми
механизмами первичного и вторичного метаболизма, влияя таким образом
на потенциал продуктивности культур клеток. В качестве регуляторов
роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма выступают
• ауксины (индолилтриуксусная кислота (ИУК), нафтилукссная кислота
(НУК) и 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4Д) и
• цитокинины -6-бензиламинопурин (БАП), N-изоптен и
6-фурфуриламинопурин (кинетин)
Что касается цитокининов, то они по разному влияют на накопление
вторичных метаболитов- одни не реагируют на внесение в среду кинетика, а
другие культуры клеток при этом начинают образовывать например, алкалоиды
(на примере культуры клеток в первом случае Datura tatula и во втором случае,
Scopolia maxima) Таким образом, существование цитокининзависимых и
цитокининнезависимых клеток, если связывать это с природой самого растения,
зависит от изменений в фенотипе (внешних), а не в генотипе (внутренних)
культуры клеток.
Второй фактор.
Для синтеза вторичных метаболитов весьма существенным является внесение в
питательную среду известных предшественников, стимулирующих
определенные ферментативные пути метаболизма. Например, внесение всем
известного фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивает
выход диосгенина на 100%
Третий фактор.
Накопление вторичных метаболитов также зависит от температуры, рН, а при
суспензионном культивировании от аэрации, перемешивания, скорости
вращения сосудов, от газового состава и т.д.
Таким образом, если мы хотим иметь гарантию возможности получения любого
продукта с фармакологической активностью, мы должны иметь в виду наиболее
благоприятные условия на стадии роста и синтеза вторичных метаболитов для
каждой культуры клеток растений (т.е. знать ее характер, капризы, требования,
наконец саму природу на уровне фенотипа и генотипа).
Итак мы уверены, что промышленное производство может эффективно
работать, реализуя возможность накопления промышленного сырья путем
выращивания клеток и тканей растений, используя каллусные и суспензионные
культуры (помня, что суспензионные культуры получают из каллусных).
Теперь перечислим преимущества каллусных культур в технологии получения
растительного сырья.
Прежде всего - это:
• - надежность и стабильность по выходу биомассы и продуктов вторичного
метаболизма
• - возможность использования каллусной системы для иммобилизации и
последующей биотрансформации
Недостаток: в необходимости применения ручного труда
В литературе приводятся интересные данные по технологии получения
субстанции женьшеня, радиолы розовой и унгерии на основе каллусных культур.
Кстати, известно, что препараты женьшеня широко применяются в
косметической, пищевой, медицинской промышленности.
Если сравнивать преимущества каллусных культур и суспензионных между
собой, то оказывается, что выход продуктов вторичного метаболизма выше
именно в каллусных культурах, но управление процессом культивирования легче
осуществлять при работе в суспензионных культурах.
При производстве настоек женьшеня, плантационное выращивание этой
культуры в количественном отношении по выходу панаксозидов имеет
преимущество перед каллусным сырьем, но по токсичности, препараты,
получаемые из каллусного сырья менее опасны.
Четвертый фактор.
Рентабельность производства на примере женьшеня стала преобладать в
технологии получения «бородатых корней», где по условиям роста и скопления
клеток возникают субпопуляции с повышенной дифференцировкой – это самые
продуктивные клетки по биоактивным веществам.
Перспективность новых технологий получения биомасс лекарственных
растений, содержащих то или иное активное начало в виде каллусных и
суспензионных культур заложена в их неоспоримых преимуществах, таких как:
1. стандартность накапливаемого сырья
2. хороший выход активного начала (см.табл.5)
3. сокращение сроков культивирования для накопления растительной
биомассы (вместо месяцев и недель счет идет на дни и часы) Краткий
комментарий с учетом кривой роста микроорганизмов в периодическом
режиме, представленной в предыдущих лекциях. В начале
логарифмической фазы (лог.фазы) клетки малы и обладают плотной
цитоплазмой, но в стационарной фазе вакуолизируются и сильно
увеличиваются в размерах. Деление клеток идет путем митоза, время
удвоения их биомассы варьирует от 25 до 100 часов. Очень важно, что из-
за низкой интенсивности дыхания клеток потребность их в кислороде
снижена и нет проблем в обеспечении культуры системами интенсивной
аэрации.
4. возможность промышленного производства биомасс экзотических
растений, малодоступных для нашей страны, например, таких как
раувольфия, диоскорея, унгерия и др.
5. использование разных технологических режимов, но предпочтительнее
растительные клетки выращивать в периодическом режиме, хотя можно
использовать и полунепрерывное и непрерывное культивирование, если
нарастание биомассы коррелирует с синтезом вторичных метаболитов.
6. использование методов иммобилизации и биотрансформации для
повышения выхода продуктов вторичного метаболизма применительно к
растительным клеткам. Здесь логично представить некоторый
комментарий по влиянию на синтез и накопление вторичных метаболитов
и уровнем их агрегатного состояния, т.е. чем ближе клетки к целому
растению тем выше у них должны быть метаболические потенциалы.
Однако здесь необходимо различать механизмы накопления вторичных
метаболитов. Они разные.
Если имеется прямая связь – один механизм накопления, когда
определяющим в росте клетки является действительно уровень агрегации,
когда достаточная ее степень может быть достигнута в медленно растущих
культурах.
В случае обратной связи включается другой механизм накопления
вторичных метаболитов и в этом случае уже определяющим фактором
является не агрегация, а кинетика скорости роста, когда первичные и
вторичные пути метаболизма по разному конкурируют за предшественник в
быстро и медленно растущих организмах.
Вывод. Иммобилизованные клетки с низкой скоростью роста, способны к
интенсивной выработке метаболитов.
Одним из основных условий иммобилизации является:
- выделение метаболита в питательную среду
- свободное извлечение метаболита из питательной среды. (например, к таким
клеткам относятся клетки, продуцирующие алкалоиды)
Способы иммобилизации
- клетки встраивают в альгинат кальция
- клетки встраивают в агарозные шарики
- клетки встраивают в трехмерные сетчатые структуры из нейлона,
порошкового металла, полиуретана. (в частности такие системы используются
для Digitalis lanata и др. стр.110.
Каковы преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с
суспензионными культурами? Это:
• многократное использование
• четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма
• увеличение продолжительности культивирования на стадии
продуцирования
• получение большого количества вторичных метаболитов.
Биотрансформация – это метод, использующий ферменты, локализованные
в клетке растения и способные менять функциональные группы добавленных
из вне химических соединений. Метод используется для повышения
биологической активности конкретной химической структуры и проведения
серий специфических химических реакций за счет включения одного или
нескольких последовательно связанных ферментов. В качестве примера
можно привести превращение дигитоксина в дигогсин клетками Digitalis
lanata .
Недеференцированные культуры клеток Digitalis lanata сами не образуют
сердечных гликозидов, но могут осуществлять реакции биотрансформации
субстратов, добавленных в питательную среду.
Биотрансформация дигитоксина в дигогсин идет за счет реакции 12-
гидроксилирования, катализируемой ферментом, находящимся в клетках
Digitalis lanata.
Итак, для дальнейшего развития этого направления получения
лекарственных средств на основе клеток растений с использованием
биотрансформации необходимо следующее:
1. селекция специализированных линий клеток
2. оптимизация условий культивирования
3. сокращения времени ферментации
4. увеличение срока работы клеток.
Растительные клетки в культуре – это важный источник ценнейших природных веществ, т.к. они сохраняют способность синтезировать свойственные им соединения: алкалоиды, эфирные масла, смолы, биологически активные вещества и т.п. Например, клетки женьшеня, переведенные в культуру, продолжают синтезировать, как и в составе целостного растения, ценное лекарственное сырье. Причем в культуре с клетками легче проводить любые манипуляции, используя индуцированный мутагенез, можно повышать продуктивность штаммов культивируемых клеток и проводить их гибридизацию гораздо проще, чем на уровне целостного организма. Кроме того, с ними, как и с прокариотическими клетками, можно проводить генно-инженерные работы.
Таким образом, клеточная инженерия позволяет конструировать клетки нового типа, комбинировать отдельные фрагменты клеток (ядра, митохондрии, пластиды, цитоплазму и хромосомы и т.п.), соединять клетки различных видов, относящиеся не только к разным родам, семействам, но и царствам.
Клеточная инженерия широко используется в селекции растений. Выделены гибриды томата и картофеля, яблони и вишни. Регенерированные из таких клеток растения с измененной наследственностью позволяют синтезировать новые формы, сорта, обладающие новыми свойствами и устойчивые к неблагоприятным условиям среды и болезням. Этот метод широко используется и для «спасения» ценных сортов, пораженных вирусными болезнями.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 1845; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!