Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
Nbsp; 1.Пути решения проблем экологии и охраны окружающей среды методами биотехнологии. Переработка и утилизация промышленных отходов. Очистка промышленных стоков. Биодеградация ксенобиотиков. Экологическая биотехнология связана с использованием биологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды (биологическая очистка сточных вод, загрязненного воздуха, твердых отходов). Наиболее развитым направлением экологической биотехнологии в настоящее время является биологическая очистка сточных вод, как промышленных, так и бытовых. Биологическая очистка вод – метод очистки бытовых и промышленных сточных вод, основанный на способности организмов (главным образом, бактерий) к разрушению (минерализации) загрязнений органического происхождения. Различают 2 вида биологической очистки: аэробная и анаэробная. Космическая биотехнология делает первые шаги в космосе, осваивая специфические неземные условия. Очевидно, что космос создает для биотехнологических процессов не только большие трудности, но и большие преимущества. Они обусловлены, главным образом, невесомостью, существенно изменяющей течение физико-химических процессов, на которых основаны многие биотехнологии. Невесомость создает особые условия, важные для осуществления биотехнологических процессов: - Редуцирует конвекции, вызванные плавучестью, и исключает седиментацию (осаждение под действием гравитационных сил); - Делает силы поверхностного натяжения выше гравитационных сил; - Обеспечивает протекание процессов вне емкостей. В земных условиях температурные различия между жидкостями после их смешивания быстро выравниваются в результате конвекционных перемещений, вызванных различными плотностями теплых и холодных слоев жидкости. В условиях невесомости этого не происходит, что крайне важно для процессов разделения систем – сохраняется гетерогенность фаз, что качественно улучшает разрешающую способность методов разделения, повышает выход и чистоту получаемых продуктов. Кроме того, невесомость способствует созданию благоприятных условий для процессов кристаллизации белков – важного для многих биотехнологий процесса получения высококачественных белковых продуктов. Другая из вышеупомянутых особенностей космических условий состоит в отсутствии стенок сосудов, что важно, поскольку исключаются возмущающие нормальное течение процесса пристеночные явления, меняющие физико-химические свойства жидкости и оказывающие воздействие на поведение находящихся в ней компонентов. К тому же и сами стенки, какими бы они не были нейтральными, являются источниками загрязнений и дополнительных электрических, химических сил, могут избирательно сорбировать вещества. Условия невесомости более благоприятны также для такого процесса, как инкапсулирование клеток в полупроницаемые мембраны, например, клетки поджелудочной железы животных, которые затем можно имплантировать в тело больных сахарным диабетом, где они могут продуцировать инсулин. Инкапсулированные клетки печени можно использовать для создания искусственных органов с целью очистки крови. На современном этапе выделяются следующие направления рационального расхода водных ресурсов: более полное использование и расширение воспроизводства ресурсов пресных вод; разработка новых биотехнологических процессов, позволяющих предотвратить загрязнение водоемов. Загрязнение поверхностных и подземных вод можно подразделить на несколько типов: · механическое, сопровождающееся повышением содержания механических примесей и относящееся в основном к поверхностным видам загрязнений; · химическое, обусловленное присутствием в воде органических и неорганических веществ токсического и нетоксического действия; · биологическое, связанное с наличием в воде разнообразных патогенных микроорганизмов, грибов и мелких водорослей; · радиоактивное и тепловое. Основные источники загрязнения и засорения водоемов - недостаточно очищенные СВ промышленных и коммунальных предприятий, крупных животноводческих комплексов, отходы производства при разработке рудных ископаемых (воды шахт, рудников); сбросы водного и железнодорожного транспорта; пестициды и т.д. Загрязняющие вещества, попадая в природные водоемы, качественно изменяют их состав. СВ содовых, сульфатных, азотно-туковых заводов, обогатительных фабрик свинцовых, цинковых, никелевых руд, содержащие кислоты, щелочи, ионы тяжелых металлов, меняют физические свойства воды (появление неприятных запахом, привкусов и т.д.). СВ нефтеперерабатывающих, нефтехимических заводов, предприятий органического синтеза содержат различные нефтепродукты, аммиак, альдегиды, смолы, фенолы и другие вредные вещества. Вследствие окислительных процессов уменьшается содержание в воле кислорода, ухудшаются ее органические показатели. Нефть и нефтепродукты - основные загрязнители внутренних водоемов, вод и морей Мирового океана - создают разные формы загрязнения: плавающую на воде нефтяную пленку, осевшие на дно водоемов тяжелые фракции. Вода приобретает токсические свойства и представляет собой угрозу для всего живого: 12 г нефти делают непригодной для употребления 1 т воды. Вредным загрязнителем промышленных вод являемся фенол, содержащийся в сточных водах многих нефтехимических предприятий. На жизнь населения водоемов пагубно влияют СВ целлюлозно-бумажной промышленности. Окисление древесной массы сопровождается поглощением значительного количества кислорода, что приводит к гибели икры, мальков и взрослых рыб. СВ имеющие повышенную радиоактивность (100 кюри на 1 л и более), подлежат захоронению в подземные бессточные бассейны и специальные резервуары. В значительной степени загрязняют водоемы моющие синтетические средства, широко используемые в быту, промышленности и сельском хозяйстве и парализующие жизнедеятельность бактерий. Пестициды, попадая в водоемы, накапливаются в планктоне, рыбе и по цепочке питания попадают в организм человека, действуя отрицательно как на отдельные органы, так и на организм в целом. СВ, содержащие отходы кожевенной и целлюлозно-бумажной промышленности, сахарных и пивоваренных заводов, предприятий мясомолочной, консервной и кондитерской промышленности, служат причиной органических загрязнений водоемов. Нагретые сточные воды тепловых электростанций вызывают тепловое загрязнение, которое резко изменяет термический режим, отрицательно влияет на флору и фауну водоемов. Возникают благоприятные условия для массового развития в водохранилищах сине-зеленых водорослей (так называемое «цветение воды»). Методы очистки СВ (механические, химические, физико-химические и биологические). Применение того или иного метода в каждом конкретном случае определяется характером и степенью вредности примесей. 1. Механические методы. Сущность этих методов состоит в том, что из СВ путем отстаивания, центрифугирования, просеивания и фильтрации удаляют механические примеси. Грубодисперсные частицы в зависимости от размеров улавливаются решетками, ситами, песколовками, навозоуловителями, нефтеловушками и т.д. Механическая очистка позволяет выделять из бытовых сточных вод до 60-75% нерастворимых примесей, а из промышленных – до 95%, многие из которых как ценные примеси используются в производстве. 2.Химические методы. Хлорирование в настоящее время является самым распространенным среди химических методов способом обеззараживания воды. Реагент сравнительно недорог, активен, обладает широким спектром антимикробного действия, легко дозируется и контролируется. В основном, используется сжиженный хлор, сохраняемый в баллонах под давлением. Хлор убивает микроорганизмы и вступает в реакцию с аммиаком. Оставшийся в избытке хлор растворяется в воде, защищая тем самым воду от любого нового источника загрязнения. Однако в последнее время появились многочисленные данные, которые свидетельствуют, что хлорирование питьевой воды и сточных вод приводит к образованию хлорорганических соединений, в т.ч. хлораминов. Хлорорганика вызывает высокие уровни мутагенной активности и токсичности, канцерогенные эффекты. Это усугубляется тем, что образующиеся хлорорганические соединения обладают высокой стойкостью, вызывая загрязнение водоемов на значительной площади. В связи с выше изложенным, потребление хлора в Европе, США, Японии сокращается. Воду обрабатывают озонированием, ультрафиолетовым облучением и т.д. Однако, несмотря на многочисленные недостатки хлора и его соединений, отказ от них полностью в ближайшее время невозможен, поскольку ни один метод, кроме серебрения воды не обладает необходимым последействием. 3.Физико-химические методы используют для удаления тонкодисперсных и растворенных неорганических примесей, а также разрушения органических и плохо окисляемых веществ. В арсенал этих методов входит электролиз, окисление, сорбция, экстракция, ионообменная хроматография, ультразвук, высокое давление, озонирование и др. 4.Биохимическая очистка основана на способности микроорганизмов использовать для питания находящиеся в сточных водах вещества (кислоты, спирты, белки, углеводы и т.д.), являющиеся для них источником энергии. В процессе питания микроорганизмов происходит прирост их массы. В сообщество микроорганизмов (биоценоз) входит множество различных бактерий, простейших и ряд более высокоорганизованных микроорганизмов (микроводорослей, грибов, дрожжей и др.). Основная роль в сообществе принадлежит бактериям, число которых составляет 106-1014 клеток на 1 г сухой биологической массы. Число родов бактерий может достигать 5-10, а видов - несколько десятков и даже сотен. Масса микроорганизмов создает так называемый активный ил с концентрацией до 2-5 г/л СВ (в искусственных сооружениях типа аэротенков). Захват примесей микроорганизмами осуществляется различными путями. Основные из них: связывание примесей поверхностью клеток (адсорбция, в данном случае биосорбция); внутриклеточное накопление, внеклеточное осаждение (биокоагуляция) и комплексообразование. Для увеличения емкости биосорбентов на них воздействуют щелочными или органическими растворами, ультразвуком и т.п., причем сорбционная активность мертвых клеток микроорганизмов, как правило, выше, чем живых. Известны два вида процессов с участием микроорганизмов: окислительные (аэробные) в присутствии кислорода, наиболее распространенные в очистке сточных вод; восстановительные (анаэробные) в отсутствие кислорода. Оптимальными для процессов являются: температура 20-30°С, рН среды 5-9 (предпочтительнее 6,5.7,5); наличие кроме основных (углерода, азота, кислорода, водорода) других биогенных элементов клетки (марганца, меди, цинка, железа, кальция, натрия, калия и пр.). Биохимическая очистка СВ осуществляется в естественных и искусственных условиях. В первом случае используют почвы, проточные и замкнутые водоемы (реки, озера, лагуны биологические; после орошения пруды). Во втором используют специально построенные очистные сооружения (биофильтры, аэротенки, метантенки, биосерберы, биоконтакторы). Из специально построенных очистных сооружений рассмотрим аэротенки и биофильтры. Аэротенки - огромные резервуары из железобетона, в которых очистка происходит с помощью активного ила из бактерий и микроскопических животных, которые бурно развиваются в этих сооружениях, чему способствуют органические вещества сточных вод и избыток кислорода, поступающего с потоком подавляемого воздуха. Бактерии, склеивающиеся в хлопья, выделяют в среду ферменты, разрушающие органические загрязнения. Ил с хлопьями оседает, отделяясь от очищенной воды. Инфузории, жгутиковые, амебы, коловратки и другие мельчайшие животные, пожирая бактерии, не слипшиеся в хлопья, омолаживают бактериальную массу ила. Следует отметить, что уже через несколько минут после контакта ила со сточной водой обычно концентрация в ней органических веществ снижается более, чем наполовину. В целом, содержание органического вещества в стоках в результате прохождения через аэротенки сокращается на 90%. Биофильтры - находят широкое применение при очистке как бытовых, так и производственных сточных вод. Биофильтр представляет собой резервуар, который заполняется загрузочным материалом (гравий, керамзит, шлак). Сточная вода подается выше поверхности загрузочного материала, равномерно под ней распределяется через загрузочный материал, на поверхности которого образуется биологическая пленка (биоценоз), аналогичный «активному илу» в аэротенке. 2 Рис. 12. Схема биофильтрата: 1 - подача сточных вод ( СВ); 2 - распределитель СВ; 3 - загрузочный материал; 4 - поддерживающая решетка; 5 - отведение очищенных СВ При эксплуатации сооружений биологической очистки следует тщательно соблюдать технологический регламент их работы, не допускать перегрузок и особенно залповых поступлений токсических компонентов, значительных отклонений от активной реакции среды, т.к. эти нарушения могут губительно сказаться на жизнедеятельности микроорганизмов и вывести биологические окислители из строя. Обеззараживание СВ, прошедших стадию биологической очистки, проводят газообразным хлором или при помощи озона, а также электромагнитного импульса. Сброс СВ в черте населенного пункта допускается в исключительных случаях на основании разрешений, выдаваемых органами по охране ОПС и согласованных с органами государственного санитарного надзора. При очистке СВ применяют и метановое сбраживание, которое осуществляется в реакторах - метантенках в основном двух типов: в реакторах без фиксации биомассы и в реакторах с прикрепленной биомассой. В качестве подложки, к которой прикрепляется биомасса, используют мелкий песок, окись алюминия и другие носители. В последнее время анаэробное метановое брожение применяют и для детоксикации стоков. Анаэробные бактерии помимо деградации углеводов, липидов, белков нуклеиновых кислот способны разрушать и многие отходы нефтехимической промышленности, например, бензойную кислоту 4С6Н5СООН ® 15СН4 + 13СО2 В настоящее время разработана биотехнология детоксикации стоков производства бензальдегида, предусматривающая использование ассоциации штаммов псевдомонад в проточно аэрируемом биореакторе. Эта система полностью очищала образцы реальных СВ от бензальдегида (250 мг/л), бензилового спирта (200 мг/л), толуола и дихлортолуола (до 100 мг/л). Нитрофенолы - одни из самых опасных загрязнителей биосферы, механизм токсического действия которых основан на нарушении процессов клеточного дыхания. Поступая в окружающую среду, они длительное время сохраняются в природных объектах. Были выделены 13 штаммов бактерий, которые могли утилизировать нитрофенолы в качестве единственных источников углерода и азота. Известен ряд публикаций о применении биореактора с микроорганизмами, иммобилизованными на оригинальном волокнистом носителе «ВИЯ», который очищал СВ производства древесноволокнистых плит от фенола, формальдегида и нефтепродуктов. Для разложения фенола в стоках также применялись дрожжи и грибы. Анилин - чрезвычайно токсическое вещество ПДК = 0,0001 мг/л - входит в состав сточных вод различных производств. Известны способы микробной очистки промышленных стоков от этого токсиканта. СВ производства полиазоцианатов, содержащие анилин, полностью очищались от токсикантов с помощью культур псевдомонад, иммобилизованных на волокнистых носителях. Подводя итог по всем перечисленным методам очистки СВ, можно прийти к заключению, что самый рациональный вариант очистки - это применение на первых этапах физико-химических и химических методов, в результате чего концентрация токсических веществ снизится до физиологических в доступных для селекционированных микроорганизмов концентраций. На втором этапе - подача стоков на локальные очистные сооружения, содержащие ассоциации высокоактивных микробных культур и лишь после этого - сброс слаботоксичных сточных вод на биологические очистные сооружения.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Противоопухолевые антибиотики. Механизмы действия. Ферментативная внутриклеточная активация некоторых противоопухолевых антибиотиков. Механизмы резистентности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам. Р-170 гликопротеин и плейотропная резистентность. Пути преодоления плейотропной антибиотикорезистентности.
Противоопухолевые антибиотики
Противоопухолевые антибиотики могут обладать, но могут и не обладать
антимикробной активностью, что будет зависеть от того, проникают ли они внутрь микроорганизмов. Поотивоопухолевые антибиотики подавляют синтез нуклеиновых кислот.
Классификация противоопухолевых антибиотиков:
1. противоопухолевые антибиотики, которые действуют на синтез
предшественников пуринов и пиримидинов. (представителем таких
антибиотиков является азосерин, который подавляет синтез пуринов и
является структурным аналогом глутамина).
2. противоопухолевые антибиотики, которые действуют на стадии
включения нуклеотидов в РНК. Такие антибиотики являются аналогами
аденозина (нуклеотид). К ним относятся тойокомицин, формицин, 5-
фторурацил.
3. ДНК-тропные антибиотики (реагируют более активно с ДНК опухолевых
клеток). Это группа актиномицинов, в основе действия которых
находится реакция с парами оснований (они имеют хромофор и две
пептидные цепи). В результате их действия прекращается синтез по
матрице ДНК. Представителями этой группы антибиотиков являются:
дактиномицин- продукт жизнедеятельности актиномицета Streptomyces
parvuilus, оливомицин
Продуцируется лучистым грибом Actinomyces olivoreticuli,
и хромомицин.
4. Группа антрациклинов. В своей структуре они имеют 4 шестичленных
кольца и аминосахар. Продуцентами этой группы антибиотиков является
актиномицеты.
Представители этой группы: даунорубицин, доксорубицин. Их применяют
для лечения лейкозов, рака легких, рака молочной железы. Антрациклины
кардиотоксичны, так как они в клетке подавляют синтез ДНК и РНК и
вызывают в ДНК одно и двунитевые разрывы.
5. Митомицин отличается тем, что предварительно активируется в клетке
(восстанавливается) и сшивает комплементарные нити ДНК, подавляя
репликацию ДНК ( в этом случае нити ДНК не могут разойтись).
6. Блеомицин - характеризуется избирательным подавлением синтеза ДНК,
вызывая фрагментацию молекул ДНК. Он способен накапливаться в коже и
поэтому особенно эффективен при раке кожи и слизистых оболочек. Этот
антибиотик является продуктом жизнедеятельности гриба и по структуре
является полипептидом.
Пути повышения эффективности: создание липосомальных лекарственных форм антибиотиков, применение коньюгатов цефалоспоринов с фторхинолами .Последние рассматривают как «proddrugs» (предлекарств), механизм их действия связан с подавлением активности транспептидаз пептидогликана и ДНК- гиразы. Так,.оливомицин,.рубомицин ,.доксорубицин,.блеомицин подавляют синтез и ДНК, и РНК одновременно поэтому очень токсичны.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация антибиотика, ингибирующая (задерживающая) рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта. При определении лекарственной устойчивости используют чистую культуру возбудителя, выделенную до начала лечения антибиотиками. Изучение чувствительности проводят методом диффузии в агар с применением стандартных дисков или методом серийных разведений в жидких и плотных средах.
Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисковосновано на диффузии антибиотика в питательную среду. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким образом, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тест-микроорганизмов соответствовали международным стандартам. В 2004 году Госсанэпиднадзором России утверждена новая инструкция определения чувствительности к антибиотикам, учитывающая общепринятые международные стандарты в этой области. Согласно этим рекомендациям для исследования берут 3-5 колоний выделенной чистой культуры, из которых затем готовится клеточная взвесь на физиологическом растворе или бульоне (Мюллер-Хинтона). С помощью оптического стандарта мутности на 0,5 ед. (по Mс Farland, что соответствует 1,5 х 108 КОЕ/мл) клеточная взвесь стандартизируется. Затем стерильным ватным тампоном, смоченным в приготовленной взвеси, исследуемые бактерии засевают в чашке Петри со специальной средой (чаще всего агар Мюллер-Хинтона). Заштриховав всю поверхность агара вначале один раз, её заштриховывают еще дважды, предварительно вращая чашку каждый раз на 60º. Стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от краев и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста исследуемых бактерий. Если бактерии чувствительны к данному соединению, то вокруг дисков образуется зона задержки роста. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному антибиотику. Окончательный результат оценивается по специальным таблицам.
Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундируемым в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность методом серийных разведений. Жидкую среду (пригодную для роста данного микроба) разливают по 2 мл в 10 пробирок. Готовят раствор антибиотика. содержащий 100 ед. в 1 мл и добавляют 2 мл раствора в 1-ую пробирку. После тщательного перемешивания 2 мл переносят в следующую пробирку и т.д. Из 9-ой пробирки 2 мл удаляют. Десятая пробирка не содержит антибиотика и служит контролем. Суточную культуру микроба разводят с использованием стандарта мутности до густоты 10000 микробов в 1 мл. После чего в каждую пробирку вносят по 0.2 мл взвеси. После 20 ч инкубации в термостате учитывают результат. Среда в пробирках, в которых антибиотик находится в концентрациях, достаточных для подавления роста микроорганизмов, остается прозрачной. Наименьшая концентрация антибиотика, при которой размножение микроорганизмов уже не происходит, а содержимое пробирок остается прозрачным, соответствует наименьшей ингибирующей концентрации данного антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма и рассматривается как бактериостатическая, что означает задержку роста бактерий, но не наличие их гибели. Для определения бактерицидной концентрации исследуемого антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма (это значит, концентрации препарата, в которой он вызывает гибель клеток) проводят посев бактериологической петлей из пробирок, содержимое которых не помутнело, на полноценную питательную агаризованную среду. Отсутствие роста свидетельствует, что в данной пробирке микроорганизмы полностью убиты данным антибиотиком.
Метод Е-тестов(от англ. еllipse – эллипс, т.к. при наличии чувствительности образуется зона задержки роста эллиптической формы) – сочетает в себе достоинства метода серийных разведений и метода дисков. Вместо дисков используются полоски фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями антибиотика. Полоски помещают на поверхность питательного агара, засеянного исследуемой культурой. Если бактерии чувствительны к действию данного препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, возникает эллипсовидная зона.
Метод серийных разведений антибиотика в агаризованной среде удобен тем, что позволяет в одном опыте проверить чувствительность к данному антибиотику нескольких микроорганизмов. Разведения антибиотика готовят в стерильной агаризованной среде. Для этого в нее добавляют требуемое количество исходного раствора антибиотика, тщательно перемешивают и заливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара дно чашки с наружной стороны делят маркером на сектора. Каждую исследуемую культуру засевают штрихом с помощью бактериологической петли на отдельный сектор в чашки с разными концентрациями антибиотика. Чашки помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста и развития изучаемых бактерий и инкубируют в течение 40 – 72 часов. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста бактерий в сравнении с ростом на среде в контрольной чашке. Бактерии считаются чувствительными к антибиотику в такой его концентрации, при которой их рост полностью подавляется.
с.36. с.162 определение Основы учения об антибиотиках: Учебник.
6-ое изд. Н.С. Егоров.
М.: Изд. МГУ; Наука, 2004
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 384; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!