Биотехнология стероидных гормонов. Микробиологический синтез гидрокортизона, получение из него путём биоконверсии преднизолона
Методы совершенствования биообъектов. Традиционные методы селекции. Отбор спонтанных мутаций. Индуцированные мутации. Мутагены, механизмы действия. Классификация мутаций. Проблемы генетической стабильности мутантов по признаку образования целевого биотехнологического продукта.
Совершенствование биообъектов методами мутагенеза и селекции
Как правило, работающий с биообъектом биотехнолог крайне заинтересован в его совершенствовании независимо от того, на какой ступени "лестницы живых существ" находится этот биообъект. Если организм, выделенный из природной среды (по жаргонному выражению - «дичок») не будет подвергнут совершенствованию, то производственный процесс образования целевого продукта или экономически нецелесообразен или технически трудно осуществим. Наиболее четко эта тенденция прослеживается в случае биообъектов, принадлежащих к микроорганизмам. Изменение биообъекта, благоприятное для его использования в производстве, должно передаваться по наследству и, соответственно, должно быть вызвано мутацией. Следует подчеркнуть, что мутации – это первоисточник изменчивости организмов, создающий основу для эволюции. Однако, для микроорганизмов сравнительно недавно (во второй половине XIX века) был открыт еще один источник изменчивости - перенос чужеродных генов, то есть своего рода «генная инженерия природы».
|
|
|
Долгое время понятие мутации относили только к хромосоме у прокариот и хромосомам (ядру) у эукариот. В настоящее время, кроме понятия хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических (плазмидных у прокариот, митохондриальных и плазмидных у эукариот).
Мутации могут быть обусловлены как перестройкой репликона (изменением в нем числа и порядка расположения генов), так и изменениями внутри индивидуального гена.
Применительно к любым биообъектам, но особенно часто в случае микроорганизмов, выявляются так называемые спонтанные мутации. К спонтанным мутациям относят такие мутации, которые обнаруживаются в популяции клеток без какого-либо специального воздействия на нее.
По выраженности почти любого признака, клетки в микробной популяции составляют вариационный ряд. Большинство клеток имеют среднюю выраженность признака. "Плюс" и "минус" - отклонения от среднего значения встречаются в популяции тем реже, чем больше величина отклонения в любую сторону.Изменение первичной структуры ДНК в
конкретном ее участке, что, в конечном счете, приводит к изменению фенотипа биообъекта. Меняется биосинтетическая способность биообъекта: либо изменяется набор его ферментов, либо активность некоторых из них
|
|
|
Спонтанные мутации встречаются, как правило, довольно редко. Разброс по степени выраженности признаков обычно невелик.
Совершенствование биообъектов путем предварительного мутагенеза и последующей селекции оказалось гораздо более действенным. В этом случае разброс мутантов по выраженности различных признаков (как "плюс" так и "минус") резко увеличивается. Среди них оказываются мутанты с пониженной способностью к реверсии, то есть со стабильно измененным признаком. Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами. В первом случае, как правило, это УФ-лучи, гамма-лучи, рентгеновские лучи; во втором - нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители, некоторые природные вещества (например, из ДНК-тропных антибиотиков, неприменяемых вследствие их токсичности в инфекционной клинике).
Механизм активности как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным действием на ДНК (прежде всего на азотистые основания ДНК, что выражается в сшивках, димеризации, алкилировании последних, интеркаляции между ними).
Подразумевается, естественно, что повреждения не приводят к летальному исходу. Таким образом, после обработки биообъекта мутагенами (физическими или химическими), их воздействие на ДНК приводит к частому наследственному изменению уже на уровне фенотипа (тех или иных его свойств). Последующей задачей является отбор и оценка именно нужных биотехнологу мутаций. Для их выявления обработанная культура высеивается на твердые питательные среды различного состава. Перед высевом ее разводят с таким расчетом, чтобы на твердой среде не было сплошного роста, а формировались отдельные колонии, образуемые при размножении именно отдельных клеток. Затем колония пересевается и полученная культура (клон) проверяется по тем или иным признакам в сравнении с исходной культурой. Эта селекционная часть работы в целом весьма трудоемка, хотя приемы, позволяющие повысить ее эффективность, постоянно совершенствуются. Так, изменяя состав твердых питательных сред, на которых вырастают колонии, можно сразу получить первоначальные сведения о свойствах клеток этой колонии в сравнении с клетками исходной культуры. Для высеивания клонов с разными особенностями метаболизма используют так называемый «метод отпечатков», разработанный Дж.Ледербергом и Э.Ледсрберг. Популяция микробных клеток разводится таким образом, чтобы на чашке Петри с питательной средой вырастало около ста колоний и они были бы четко отделены друг от друга. На металлический цилиндр с диаметром, приближающимся к диаметру чашки Петри, надевают бархат; затем все стерилизуют, создавая, таким образом, «стерильное бархатное дно» цилиндра. Далее прикладывают это дно к поверхности среды в чашке с выросшими на ней колониями. При этом, колонии как бы «отпечатываются» на бархате. Затем этот бархат прикладывается к поверхности сред разного состава. Таким образом, можно установить, какая колония в исходной чашке (на бархате расположение колоний отражает их расположение на поверхности твердой среды в исходной чашке) соответствует, например, мутанту, нуждающемуся в конкретном витамине, или конкретной аминокислоте; или какая колония состоит из мутантных клеток, способных к образованию фермента, окисляющего определенный субстрат; или какая колония состоит из клеток, получивших резистентность к тому или иному антибиотику и т.п.
|
|
|
|
|
|
В первую очередь, биотехнолога интересуют те мутагенные культуры, которые обладают повышенной способностью к образованию целевого продукта. Продуцент целевого вещества, который является в практическом отношении наиболее перспективным, может многократно подвергаться обработке разными мутагенами. Новые мутантные штаммы получаемые в научных лабораториях разных стран мира служат предметом обмена при творческом содружестве, предметом лицензионной продажи и т. п.
Потенциальные возможности мутагенеза (с последующей селекцией) обусловлены зависимостью биосинтеза целевого продукта от многих метаболических процессов протекающих в организме продуцента. Например, повышенную активность организма, образующего целевой продукт можно ожидать, если мутация привела к дупликации (удвоению) или амплификации (умножению) структурных генов, включенных в систему синтеза целевого продукта. Далее активность можно повысить, если за счет разных типов мутаций будут подавлены функции репрессорных генов регулирующих синтез целевого продукта. Весьма эффективным путем увеличения образования целевого продукта является нарушение системы ретроингибирования. Повышение активности продуцента может быть также достигнуто вследствие изменения (за счет мутаций) систем транспорта предшественников целевого продукта в клетку. Наконец, иногда целевой продукт при резком увеличении его образования отрицательно влияет на жизнеспособность собственного продуцента (так называемый суицидный эффект). Так, повышение резистентности продуцента к образуемому им же веществу часто бывает необходимым условием для получения, например, суперпродуцентов антибиотиков.
Помимо дупликации и амплификации структурных генов, мутации могут носить характер делеции – «стирания», то есть «выпадения» части генетического материала. Мутации могут быть обусловлены транспозицией (вставкой участка хромосомы в новое место) или инверсией (изменением порядка расположения генов в хромосоме). При этом геном мутантного организма претерпевает изменения ведущие в одних случаях к потере мутантом определенного признака, а в других - к возникновению у него
нового признака. Гены на новых местах оказываются под контролем иных регуляторных систем. Кроме того, в клетках мутанта могут появиться несвойственные исходному организму гибридные белки за счет того, что под контролем одного промотора оказываются полинуклеотидные цепи двух (или более) структурных генов, ранее отдаленных друг от друга.
Немалое значение для биотехнологического производства могут иметь и так называемые «точечные» мутации. В этом случае изменения происходят в пределах только одного гена. Например, происходит выпадение или вставка одного или нескольких оснований. К «точечным» мутациям относятся трансверсия (когда происходит замена пурина на пиримидин) и транзиция (замена одного пурина на другой пурин или одного пиримидина на другой пиримидин). Замены в одной паре нуклеотидов (минимальные замены) при передаче генетического кода на стадии трансляции ведут к появлению в кодируемом белке вместо одной аминокислоты - другой. Это может резко изменить конформацию данного белка и, соответственно, его
функциональную активность, особенно в случае замены аминокислотного
остатка в активном или аллостерическом центре.
Одним из самых блестящих примеров эффективности мутагенеза с последующей селекцией по признаку увеличения образования целевого продукта является история создания современных суперпродуцентовпенициллина. При этом работа с исходными биообъектами (штаммы гриба Penicillium chrysogenum) выделенными из природных источников, велась,
начиная с сороковых годов прошлого века, в течение несколько десятилетий во многих лабораториях. Вначале некоторый успех был достигнут при отборе мутантов, появившихся в результате спонтанных мутаций. Затем перешли к индуцированию мутаций физическими и химическими мутагенами. В результате ряда удачных мутаций и ступенчатого отбора все более продуктивных мутантов, активность штаммов Penicillium chrysogenum, (используемых в промышленности тех стран, где производят пенициллин), сейчас в 100000 раз выше, чем у обнаруженного А.Флемингом исходного штамма, с которого началась история открытия пенициллина.
Необходимо отметить, что производственные штаммы (штамм – это
клоновая культура, однородность которой по определенным признакам
поддерживается отбором; применительно к биотехнологическому производству - производственный штамм) с такой высокой продуктивностью (это относится не только к пенициллину, но и к другим целевым продуктам) являются крайне нестабильными. Это происходит вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности клеток штамма положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении: популяция клеток высеивается на твердую среду и полученные из отдельных колоний культуры проверяются на продуктивность. При этом ревертанты (культуры с пониженной активностью) - отбрасываются.
Реверсия объясняется обратными спонтанными мутациями ведущими к возвращению участка генома (конкретного фрагмента ДНК) к его первоначальному состоянию. Специальные ферментные системы репарации участвуют в реверсии к норме, которая является эволюционным механизмом поддержания постоянства вида. Совершенствование биообъектов применительно к производству не исчерпывается только повышением их продуктивности. Хотя это направление, несомненно, является главным, оно не может быть единственным, учитывая, что успешная работа биотехнологического производства определяется многими факторами. Так, с экономической точки зрения, весьма важно получение мутантов, способных использовать более дешевые и менее дефицитные питательные среды. Если для работы в исследовательской лаборатории дорогие среды не создают особых финансовых проблем, то при крупнотоннажном производстве понижение их стоимости (хотя и без увеличения уровня активности продуцента) – крайне важно.
Другой пример: в случае некоторых биообъектов культуральная жидкость после окончания ферментации имеет неблагоприятные в технологическом отношении реологические свойства. Поэтому в цехе выделения и очистки целевого продукта, работая с культуральной жидкостью повышенной вязкости, сталкиваются с трудностями при использовании сепараторов, фильтр-прессов и т.д. Мутации, соответствующим образом меняющие метаболизм биообъекта, в значительной мере снимают эти трудности. Также большое значение в отношении гарантии надежности производства приобретает получение фагоустойчивых биообъектов. Выполнение требований по соблюдению асептических условий при проведении ферментации прежде всего касается предотвращения попадания в посевной материал (а также в ферментационный аппарат) клеток и спор посторонних бактерий и грибов (в более редких случаях водорослей и простейших).
Предотвратить проникновение в ферментер фагов вместе с технологическим воздухом, стерилизуемым путем фильтрации - крайне трудно. Не случайно вирусы в первые годы после их открытия именовались именно как «фильтрующиеся вирусы». Поэтому, основной путь борьбы с бактериофагами, актинофагами и фагами поражающими грибы – это получение устойчивых к ним мутантных форм биообъектов.
Не касаясь специальных случаев работы с биообъектами - патогенами, следует подчеркнуть, что иногда задача совершенствования биообъектов исходит из требований промышленной гигиены. Например, выделенный из природного источника продуцент одного из важных беталактамных антибиотиков в значительном количестве образовывал летучие вещества с неприятным запахом гниющих овощей. Мутации, ведущие к удалению генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе таких летучих веществ, приобрели в данном случае фактически практическое значение для производства.
Из всего выше изложенного следует, что современный биообъект используемый в биотехнологической промышленности - это суперпродуцент, который отличается от исходного природного штамма, как правило, не по одному, а по нескольким показателям. Хранение таких штаммов - суперпродуцентов представляет серьезную самостоятельную проблему. При всех способах хранения их необходимо периодически пересеивать и проверять как на продуктивность, так и на другие важные для производства свойства.
Мутагенез:
Мутагенез – искусственное получение мутаций с помощью мутагенов. Мутации – внезапные качественные изменения генетической информации.
В селекции мутагенез используют для получения перспективных мутантов животных, растений, микроорганизмов. Термин был предложен голланд. ученым де Фризом в 1901 г.
Мутант – наследственно измененная в результате мутации форма организма. Мутанты могут возникать спонтанно, либо под действием мутагенов. Большинство мутантов отличаются от исходных организмов нарушением различных структур и функций и, как правило, имеют пониженную жизнеспособность. Гораздо реже возникают мутанты, обладающие преимуществами. Такие мутанты широко используют для выведения новых сортов растений и пород животных, а также для получения штаммов микроорганизмов - продуцентов аминокислот, витаминов, антибиотиков и других биологически активных веществ. В генетике мутанты используют для изучения закономерностей мутационного процесса – строения и функционирования генетического аппарата, путей биосинтеза и т.п. Мутанты играют очень важную роль в эволюции, т.к. представляют собой материал для естественного отбора.
Мутации – внезапные, естественные или вызванные искусственно наследуемые изменения генетического материала, приводящие к изменению тех или иных признаков организм.
Различают спонтанные мутации, возникающие с относительно низкими частотами, а также индуцированные мутации, вызываемые воздействием мутагенов.
Выделяют три основные группы мутагенов:
К физическим мутагенам относят нагревание, различные виды ионизирующих излучений, ультрафиолетовое и микроволновое излучение. Первичный эффект ионизирующих и ультрафиолетовых излучений заключается в образовании одиночных или двойных разрывов в молекуле ДНК.
Мутагенным действием обладают многие химические соединения различного строения (алкилирующие соединения, нитрозосоединения, антибиотики, обладающие противоопухолевой активностью). Химические мутагены делят на мутагены прямого действия, непосредственно взаимодействующие с генетическим материалом клетки и мутагены непрямого действия, влияние которых на генетический материал клетки практически опосредованно, после ряда метаболических превращений. Однако в отличие от ионизирующих и ультрафиолетовых излучений для химических мутагенов характерна специфичность действия, зависящая от природы объекта и стадии развития клетки. При взаимодействии химических мутагенов с компонентами наследственных структур (ДНК и белками) возникают первичные повреждения последних, которые ведут к возникновению мутаций.
К биологическим мутагенам относят ДНК- и РНК-содержащие вирусы, некоторые полипептиды, белки, ряд ферментов рестриктаз, и т.п. Механизм образования мутации при действии различных биологических факторов не вполне ясны, однако агенты, содержащие нуклеиновые кислоты, могут вызывать нарушение процессов рекомбинации, что приводит к возникновению мутаций.
Мутации называют прямыми, если их проявление приводит к отклонению признаков от дикого типа, и обратными (или реверсиями), если их проявление приводит к полному или частичному восстановлению дикого типа.
Мутации бывают генеративными (происходит в половых клетках и в этом случае передается последующим поколениям), соматическими(происходит в любых других соматических клетках организма и в этом случае наследуется только при вегетативном размножении), ядерными (затрагивают хромосомы ядра), цитоплазматическими (затрагивают генетический материал, заключенный в цитоплазматических органоидах клетки – митохондриях, пластидах и т.п.).
По характеру изменения генотипа различают:
Генные мутации представляют наследственные, микроскопически не выявляемые изменения в хромосомах. Генные мутации сопряжены либо с заменой пары азотистых оснований в полинуклеотидной цепи ДНК, либо с вставкой или выпадением нескольких отдельных нуклеотидов.
Хромосомные мутации (хромосомные абберации) разделяют на внутрихромосомные и межхромосомные. К внутрихромосомным мутациям относят делецию (утрата части хромосомы), дупликацию (удвоение части хромосомы) и инверсию (изменение последовательности расположения генов по длине хромосомы за счет перевертывания – инверсии участка хромосомы на 180 °С). К межхромосомным мутациям относят транслокацию – обмен участками между двумя хромосомами.
Геномные мутации заключаются в изменении числа хромосом. Увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному набору хромосом, называют полиплоидией. Отсутствие или избыточное количество отдельных хромосом объединяют понятием анеуплоидия, которую подразделяют на гиперплоидию (увеличение числа хромосом) и гипоплоидию (потерю отдельных хромосом хромосомного набора). Геномные мутации возникают за счет повреждений в процессе мейоза ведущих к нерасхождению хромосом или хроматид по дочерним клеткам.
Мутационный процесс у микроорганизмов можно использовать более эффективно, чем у высших организмов, т.к. геном микроорганизмов гаплоидный, что позволяет выделять любые мутации в первом поколении. Преимущества микроорганизмов заключаются также в: простоте генетической организации бактерий по сравнению с эукариотами, более простой генетической регуляции, отсутствии или не столь сложном взаимодействии генов. Используя методы генетической инженерии можно заставить бактерии или другие группы микроорганизмов продуцировать те соединения, синтез которых в дикой природе им никогда не был присущ.
Как уже отмечалось выше, биотехнология возникла на стыке многих наук. Для данной науки свойственна трансдисциплинарность. Фундамент биотехнологии составили такие науки, как микробиология, вирусология, физиология, биохимия, генетика, селекция, цитология, молекулярная биология, генетическая инженерия, клеточная инженерия, энзимология, иммунология, биофизика, экология, медицина, сельскохозяйственные науки, химия, физика, математика, кибернетика и др.
Биотехнология стероидных гормонов. Микробиологический синтез гидрокортизона, получение из него путём биоконверсии преднизолона.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 2092; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!