Окраска бактерий по методу Грама
Методика приготовления препарата состоит из следующих стадий:
1. готовится фиксированный мазок исследуемых бактерий;
2. на мазок наносят 2-3 капли раствора генцианвиолета на 2-3 минуты и смывают водой;
3. наносят 2-3 капли раствора Люголя на 1-2 минуты и смывают водой;
4. препарат погружают на 30-40 секунд в 96% спирт и быстро промывают водой;
5. окрашивают препарат разбавленным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают. Грамположительные бактерии будут фиолетовыми, грамотрицательные - красными. Микроскопируют препарат с объективом 90.
Условия выращивания микроорганизмов.
При исследовании пищевых продуктов для выявления в них микроорганизмов часто требуется проводить их выращивание в условиях, обеспечивающих их интенсивное размножение. Наиболее важным является правильный подбор питательных сред и установление оптимальных условий: температуры, влажности, аэрации.
Питательные среды.
Питательные среды должны содержать вещества, необходимые для построения микробной клетки, а также источники энергии. В их состав входят органогены (азот, углерод, кислород, водород); макроэлементы (натрий, калий, кальций, сера, фосфор, железо); микроэлементы (молибден, цинк, марганец) и факторы роста (витамины, некоторые аминокислоты, гормоны).
Питательные общеупотребительные среды содержат постоянные количества аминного азота 80-120 мг%, общего азота 250-300 мг%, NaCl 0,5-0,8%, а также определенную кислотность среды. Так, для бактерий оптимальной рН является 7,0-7,4; а для дрожжей и плесневых грибов - в зоне 4,5-6,5. Активная кислотность регулируется добавлением растворов соляной, молочной кислот или пищевой соды. Питательные среды должны обладать буферностью и содержать до 80% влаги.
|
|
|
Питательные среды бывают как натуральные (молоко, мясной или рыбный бульон, овощи, фрукты), так и искусственные, т.е. приготовленные с добавлением каких-либо дополнительных веществ.
Иногда применяют дифференциально-диагностические среды, которые позволяют различать микроорганизмы, основываясь на особенностях их обмена веществ.
Применение элективных (избирательных) сред позволяет выделить определенные микроорганизмы из множества сопутствующих им. Для выращивания бактерий наиболее часто используют мясо-пептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), мясо-пептонный желатин (МПЖ). Для выращивания грибов и дрожжей применяют солодовое сусло (СС) и сусло-агар (СА).
Универсальной питательной среды для развития всех микроорганизмов нет. Однако по назначению различают стандартные, элективные и дифференциально-диагностические среды. По физическому состоянию (консистенции) питательные среды могут быть жидкими и плотными. Для уплотнения сред применяют желатин или агар-агар. Агар-агар – вещество растительного происхождения (из морских водорослей), он индифферентен микробиологически, т.е. не усваивается микроорганизмами. Агар-агар плавится при 90-100°С, застывает при 36-40°С. Плотные среды готовят, добавляя к жидким до 1,5-3% агар-агара.
|
|
|
Желатин – белковое вещество животного происхождения. Застывает желатиновый гель при 20°С, разжижается 22-27°С. Применяют ограничено, т.к. температура выращивания большинства микроорганизмов 35-37°С. Питательные среды с 10-15% желатина используются для изучения протеолитической способности микробов.
В настоящее время организованно производство многих видов сухих питательных сред (сухой питательный агар, среды Эндо, Сабуро, МПБ и др.).
К стандартным средам (общеупотребительным) относятся:
1. Мясо-пептонный бульон (МПБ) (стерилизуют 20 мин. при 120°С в автоклаве).
2. Дрожжевой автолизат (получают из пресованых дрожжей автолизом).
3. Мясо-пептонный агар (МПА) (стерилизуют 30 мин. при 120°С).
4. Мясо-пептонный желатин (МПЖ) (дробная стерелизация).
5. Сухой питательный агар (стерилизуют при 120°С в автоклаве 20 мин.)
|
|
|
6. Солодовое сусло для плесеней и дрожжей.
7. Сусло-агар (СА) для плесеней и дрожжей (стерелизуют 30 мин. при 120°С в автоклаве).
К элективным питательным средам относят:
1. Среды для выращивания анаэробных микробов (мясопептонный печеночный бульон Китт-Тароци-МППБ, полужидкий агар для анаэробов).
2. Среды для выращивания молочнокислых бактерий (молоко цельное, обезжиренное, гидролизованное, сывороточный агар с мелом, дрожжевой бульон).
3. Среду для выращивания осмофильных дрожжей.
4. Среду для выращивания жирорасщепляющих бактерий.
5. Среду для выращивания галофилов.
К дифференциально-диагностическим средам относят:
1. Среду Эндо (для отличия кишечной палочки от паратифозных бактерий).
2. Среду Булижа (для обнаружения бактерий группы БГКП).
3. Среду Кесслера (жидкая) для обнаружения БГКП.
4. Среду Симмонса (для дифференциации БГКП).
Эти среды позволяют различать микроорганизмы, основываясь на особенностях их обмена веществ.
Температура культивирования.
В соответствии с оптимальными температурами роста различают три группы микроорганизмов: психрофилы - холодолюбивые, оптимум развития в зоне +5 - +20оС, мезофилы – оптимум развития выше +25 - +35оС, термофилы – оптимум развития выше +45оС. Необходимая температура обеспечивается термостатами.
|
|
|
Аэрация.
По отношению к кислороду микроорганизмы делятся на аэробы (использующие кислород как окислитель) и анаэробы (не использующие кислород). Для успешного выращивания важен не сам кислород, а окислительно – восстановительный потенциал питательных сред. Этот потенциал rH2 для аэробных микроорганизмов должен быть не ниже 10 единиц, а для анаэробных – не выше 5.
Стерилизация.
Питательные среды, разлитые в колбы и пробирки, закрывают ватными пробками и подвергают стерилизации.
Стерилизацию проводят в автоклаве при давлении 1 атм в течении 20-30 мин. При этом погибают как вегетативные формы, так и споры бактерий, дрожжей и плесеней.
Для сред, заметно изменяющих свои свойства при автоклавировании, применяют стерилизацию текучим паром дробным методом.
Жидкие питательные среды, не выдерживающие нагрева, стерилизуют фильтрованием через специальные бактериологические фильтры.
Стерилизацию посуды, ваты, песка и др. проводят в сушильных шкафах при температуре 160-170оС в течении 1,5 –2 ч.
Мелкие предметы (бактериологические иглы, предметные стекла, шпатели) стерилизуют фламбированием, т.е обжигом в пламени горелки.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 491; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!